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博翀凝集素芯片在精子耐冻性标志物发现的应用
发布时间：2018-07-09 16:07 | 点击次数：
不孕不育是现代家庭的一个重要生活问题。精子冷冻储藏技术广泛应用于辅助生殖技术和精子库储备。而精子耐冻性差异巨大，目前尚未发现有效指标预测冷冻复苏后的精子质量，因而急需开发精子耐冻性标志物。精子表面有一层厚厚的多糖复合物，在精子成熟、游动和受精过程中发挥重要功能，可能与精子的冷冻耐受性相关。
近期，上海计划生育研究所施惠娟研究组和上海女性生殖内分泌相关疾病重点实验室主任孙晓溪研究组合作，利用博翀生物凝集素芯片（Lectin Microarray）对精子表面糖复合物进行系统研究，发现了精子耐冻性的糖标志物凝集素ABA（双孢菇凝集素），该研究成果将降低精子冷冻复苏育性检测，提高精子库冷冻储存效率，并在高水平临床杂志《Clinical Proteomics》上，详见如下解析：
方案设计：
1）精液样品收集，冷冻和解冻处理；
2）凝集素芯片分析筛选标志物；
3）流式细胞术验证候选标志物。
研究结果：
（1）精子样本冷冻-复苏分群
精子耐冻性分群和样本设计（表1），收集的精子进行冷冻和解冻处理后回收，根据回收率收集了12个精液样品（GFE，n= 6； PFE，n= 6）。其中，回收率超过50％的精液被归类为好的耐冻性精液组（GFEs），而低于30％的精液被归类为差的耐冻性精液组（PFEs）。
近期，上海计划生育研究所施惠娟研究组和上海女性生殖内分泌相关疾病重点实验室主任孙晓溪研究组合作，利用博翀生物凝集素芯片（Lectin Microarray）对精子表面糖复合物进行系统研究，发现了精子耐冻性的糖标志物凝集素ABA（双孢菇凝集素），该研究成果将降低精子冷冻复苏育性检测，提高精子库冷冻储存效率，并在高水平临床杂志《Clinical Proteomics》上，详见如下解析：
方案设计：
1）精液样品收集，冷冻和解冻处理；
2）凝集素芯片分析筛选标志物；
3）流式细胞术验证候选标志物。
研究结果：
（1）精子样本冷冻-复苏分群
精子耐冻性分群和样本设计（表1），收集的精子进行冷冻和解冻处理后回收，根据回收率收集了12个精液样品（GFE，n= 6； PFE，n= 6）。其中，回收率超过50％的精液被归类为好的耐冻性精液组（GFEs），而低于30％的精液被归类为差的耐冻性精液组（PFEs）。
表1. 项目样本设计
（2）凝集素芯片筛选发现ABA和DSL候选标志物
精子细胞荧光标记：精子GFEs组和PFEs组样本使用多聚甲醛/戊二醛固定液和PI（碘化丙啶）染料对精子进行荧光标记。
荧光标记的精子GFEs组和PFEs组样本，孵育凝集素芯片。精子细胞表面的糖链结构被相应的凝集素蛋白识别，从而精子细胞被吸附在凝集素芯片相应的凝集素蛋白点上。然后通过扫描芯片上凝集素点的精子荧光信号，从而相对定量精子表面糖谱差异。
通过比较两组样本凝集素结合信号强度，发现：双孢菇凝集素（ABA）和曼陀罗凝集素（DSL）呈现出显着差差异，GFEs的ABA结合信号强度低于PFEs，而DSL结合信号强度相反，GFEs则更高（图1）。
荧光标记的精子GFEs组和PFEs组样本，孵育凝集素芯片。精子细胞表面的糖链结构被相应的凝集素蛋白识别，从而精子细胞被吸附在凝集素芯片相应的凝集素蛋白点上。然后通过扫描芯片上凝集素点的精子荧光信号，从而相对定量精子表面糖谱差异。
通过比较两组样本凝集素结合信号强度，发现：双孢菇凝集素（ABA）和曼陀罗凝集素（DSL）呈现出显着差差异，GFEs的ABA结合信号强度低于PFEs，而DSL结合信号强度相反，GFEs则更高（图1）。
图1. 凝集素芯片筛选精子耐冻性候选生物标志物
精子GFEs和PFEs组细胞，在凝集素芯片上蛋白点ABA（图A）和DSL（图B）的结合差异，上图为统计图，下图为芯片扫描荧光信号图。
（2）流式细胞术验证 ABA是精子耐冻性的糖标志物精子GFEs和PFEs组细胞，在凝集素芯片上蛋白点ABA（图A）和DSL（图B）的结合差异，上图为统计图，下图为芯片扫描荧光信号图。
研究人员使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的ABA和DSL，通过流式细胞术（FACS）分析精子的结合信号。通过FACS检测精子与ABA结合强度，发现ABA的结合强度与精子恢复率呈显著负相关；同时分析受试者特征曲线（ROC），证明ABA可以作为检测精子耐冻性的糖生物标志物。
图2. 流式细胞术验证ABA分辨精子耐冻性组别
A. PFEs中ABA的荧光强度显着高于GEF； B. ABA的结合强度与精子恢复率呈显著负相关；
C. 受试者操作特征（ROC）曲线。
参考文献
Xin A J, et al. Comparative analysis of human sperm glycocalyx from different freezability ejaculates by lectin microarray and identification of ABA as sperm freezability biomarker [J]. Clinical Proteomics, 2018, 15(1):19.
Xin A J, et al. Comparative analysis of human sperm glycocalyx from different freezability ejaculates by lectin microarray and identification of ABA as sperm freezability biomarker [J]. Clinical Proteomics, 2018, 15(1):19.
凝集素（lectin）是自然界广泛存在具有特异识别和结合特定糖链的蛋白质，被广泛应用于糖基化修饰研究。凝集素芯片是研究动物、植物、细菌、真菌细胞或蛋白高通量检测糖基化修饰的高效工具。细胞表面糖复合物中糖链结构的异常变化往往和癌症等疾病的发生有密切的关系，凝集素芯片可以系统性高通量的研究糖链差异或变化，是解析细胞膜表面糖链信息的理想工具。
1. 特定蛋白表面糖谱构建及差异检测
Li, Y. et al. Detection and verification of glycosylation patterns of glycoproteinsfrom clinical specimens using lectin microarrays and lectin-based immunosorbent assays [J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(22):8509-8516.
2. 活细胞表面糖谱构建及差异检测
Zhou, S, et al. Lectin RCA-I specifically binds tometastasis-associated cell surface glycans in triple-negative breast cancer [J]. Breast Cancer Research, 2015, 17(1):1-14.
3. 血清或细胞/组织裂解液的疾病糖生物标志物发现
Yang, L, et al. Lectin Microarray Combined with Mass Spectrometry IdentifiesHaptoglobin-Related Protein (HPR) as a Potential Serologic Biomarker forSeparating Nonbacterial Pneumonia from Bacterial Pneumonia in Childhood [J]. Proteomics Clin Appl, 2018, e1800030.
广州博翀生物科技有限公司是一家专业提供蛋白质芯片，凝集素芯片，药物小分子芯片等产品和定制服务的高科技公司。公司成立于2009年，为中国科学院生物物理研究所成果转化的标杆企业，专注于蛋白芯片技术和产品，立志打造为国际领先的生物芯片整体服务专家。
博翀生物期待和您进行深度合作，欢迎来电来函咨询。
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