细菌性脑膜炎是新生儿/儿童死亡和发病的重要原因, 几乎所有对人类有致病性的微生物都有可能引起脑膜炎，但少数细菌，如大肠杆菌，占了急性细菌性脑膜炎的大多数病例。但病原体利用血脑屏障的潜在分子机制尚不完全清楚。

为了确定大肠杆菌与血脑屏障细胞相互作用的重要参与者，美国约翰霍普金斯大学朱衡教授研究团队利用了大肠杆菌和人类蛋白质芯片，证实了 YojI 和 IFNAR2 同介导细菌和宿主细胞相互作用。相关研究在《Anal Chem》在线发表。

研究思路及方案

1. 大肠杆菌蛋白芯片筛选病原蛋白
2. FACS 验证候选病原蛋白
3. HuProt 人蛋白芯片筛选与病原相互作用的宿主受体蛋白
4. 候选宿主蛋白验证
 

图 1. 实验思路流程图

1、大肠杆菌蛋白质组芯片筛选与 HBMEC 相互作用的大肠杆菌蛋白

研究人脑微血管内皮细胞 HBMEC 蛋白与大肠杆菌的结合，对 HBMEC 进行标记，利用大肠杆菌蛋白质组芯片进行检测，芯片扫描仪采集蛋白芯片的结合信号。进行数据分析，获得 23 个候选结合蛋白，其中有 8 个被标记为膜蛋（DgkA、GIpF、Ppx、PstC、YbaE、SapC、YojI、YgdD）。GIpF、PstC、YbaE、SapC 和 YojI 都编码转运体活性，而对 YojI 和 YbaE 的功能之前未见有研究，所以选择它们进行进一步研究。

为了验证 HBMEC 与候选蛋白的相互作用，采用流氏细胞术进行分析。在测试中，YojI 和 YbaE 显示出与 HBMEC 结合具有剂量依赖性 (图 2A−C)，表明 YojI 和 YbaE 可能会与 HBMEC 相互作用。以前的一些研究也提示 YojI 可能参与介导大肠杆菌和 HBMEC 之间的结合。
 

 

图 2. HBMEC 与候选蛋白的相互作用

（A）FACS 检测 YojI、YbaE 与 HBMEC 相互作用的阈值；（B）HBMEC 与不同浓度的 YojI 结合信号检测；（C）HBMEC 与不同浓度的 YbaE 结合信号检测。

2、YojI 与 HBMEC 相互作用的验证

为了分析 YojI 与 HBMEC 的相互作用，研究人员进行了一系列的实验。首先是 HBMEC 结合 YojI 偶联荧光微球的分析（图 3A），结果显示 YojI 偶联荧光微球组的信号强度明显高于对照组；然后还通过细胞粘附试验检测了 HBMEC 和 YojI/YojI  菌株的相互作用（图 3B），结果显示 YojI  细胞与 HBMEC 的结合显著低于 WT；此外还采用竞争性实验验证 YojI 在宿主细胞识别中的特异性（图 3C）。这些实验结果均表明 YojI 在大肠杆菌和 HBMEC 的相互作用中起着重要的作用。

由于病原菌附着于血脑屏障可引起局部炎症，因此研究人员推断如果 YojI 在大肠杆菌附着于宿主血脑屏障细胞中发挥关键作用，那么 YojI 蛋白与 HBMEC 的相互作用就可能会影响已知参与炎症的基因转录。相关研究也表明 YojI 提高了 NR4A1 和 NLRP2 的表达水平，进一步间接证明了 YojI 可能在宿主细胞识别中发挥重要作用。

 

图 3. YojI 与 HBMEC 的相互作用验证

 

（A）YojI 偶联荧光微球与 HBMEC 结合实验；（B）细胞粘附试验检测 HBMEC 和 YojI/YojI  菌株的相互作用；（C）YojI 蛋白的存在降低大肠杆菌和 HBMEC 的相互作用。

3、HuProt 人蛋白芯片鉴定 YojI 的潜在宿主受体

研究人员采用 HuProt 人蛋白芯片，鉴定大肠杆菌蛋白 YojI 所识别的宿主受体。将纯化的 YojI 蛋白进行标记并与 HuProt 人蛋白芯片进行孵育，检测荧光信号，获得候选结合蛋白。在这些候选蛋白中有 5 种膜蛋白 IFNAR2、IL10RA、NRP1、SIGLEC7 和 MC4R，其中，IFNAR2 对 YojI 的结合信号最强 (F/B:3.60)。因此，研究人员也更关注 YojI 和 IFNAR2 相互作用的进一步表征。

 

图 4. HuProt 人蛋白芯片鉴定 YojI 的潜在宿主受体

F：前台中值信号；B：背景中值信号；F/B：前背景比中位数

4、YojI 和 IFNAR2 共同介导细菌和宿主细胞相互左右

为了评估 IFNAR2 在细菌-宿主相互作用中的作用，研究人员使用基于细胞的实验来评估不同条件下大肠杆菌细胞对 HBMEC 的结合效率。通过粘附试验和菌落计数发现，当敲除 HBMEC 细胞中的 IFNAR2 在 (图 5A)，附着效率有一个小但显著的减少 (89%)(图 5A)，而当 YojI 也被敲除时，附着效率显著降低至 33% 的最低水平，说明 IFNAR2 与 YojI 之间存在叠加效应。

为了证明 IFNAR2 介导的细胞与宿主细胞相互作用的特异性，研究人员用不同浓度的抗 IFNAR2 抗体阻断 HBMEC(图 5B)，观察到大肠杆菌的附着效率随着抗体浓度的增加而逐渐降低，这表明 IFNAR2 在介导细菌-宿主细胞相互作用中发挥作用。

 

图 5. YojI 和 IFNAR2 介导的大肠杆菌与宿主细胞相互作用的验证

 

（A）与未处理的细胞相比，HBMEC 中 IFNAR2 (shRNA1) 的敲除显著降低了 WT 大肠杆菌对 HBMEC 的粘附；（B）大肠杆菌和 HBMEC 的相互作用依赖于 IFNAR2。*表示 P 值<0.05；**表示 P < 0.01

小结：

本文研究通过利用现有的大肠杆菌蛋白芯片和人蛋白芯片，快速识别病原和宿主的重要参与者。随着蛋白质芯片的不断发展，这种研究方法将在识别控制病原体与宿主相互作用的重要参与者方面具有指导意义。 

参考文献：

Feng Y, et al., High-Throughput Chip Assay for Investigating Escherichia coli Interaction with the Blood-Brain Barrier Using Microbial and Human Proteome Microarrays (Dual-Microarray Technology). Anal Chem [J], 2018, seq 18,90(18):10958-10966.

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大肠杆菌蛋白芯片简介
 

 
HuProt 人蛋白芯片简介