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【双芯合璧】结核分枝杆菌与宿主相互作用研究
发布时间：2019-06-03 16:19 | 点击次数：
结核病是由结核分枝杆菌(Mtb)引起的一种慢性传染病，Mtb与宿主细胞之间的蛋白-蛋白相互作用(PPI)常常参与细菌在宿主体内的发病机制。然而，这种系统的种间PPI并不容易获得。
近期，首都医科大学附属北京胸科医院的研究人员通过人蛋白芯片，在人宿主中识别出84个与Mtb相结合的蛋白，而后选择了两种候选蛋白SMAD2和NRF1，利用Mtb蛋白芯片进行反向筛选，找到与NRF1相结合的3个蛋白和与SMAD2相结合的6个蛋白。该研究结果可为进一步研究结核的发病机制和结核药物的开发提供潜在的靶点。相关研究结果在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》发表。
实验思路：
1）Huprot人蛋白芯片筛选与Mtb相互作用蛋白；
2）筛选并纯化候选人蛋白；
3）MTB蛋白芯片筛选与人蛋白相互作用靶点；
4）体外实验验证Mtb与宿主的蛋白相互作用。
图1. 蛋白质芯片技术识别Mtb和人蛋白相互作用
制备Mtb分泌蛋白(SP)和细胞蛋白(CP)，并分别用荧光素标记。与人蛋白芯片孵育后，筛选潜在的Mtb相互作用蛋白。为了寻找Mtb效应物，在体外表达和纯化筛选的人蛋白，并与Mtb蛋白芯片孵育。通过下拉实验和Co-IP的实验验证，确定Mtb -宿主的蛋白相互作用。
1. 人蛋白芯片筛选与Mtb相互作用的蛋白
纯化Mtb分泌蛋白(SP)和细胞蛋白(CP)，荧光标记后将SP和CP分别与人蛋白芯片孵育。通过这种方法，发现了54种与Mtb分泌蛋白(SP)相互作用的人蛋白和74种与Mtb细胞蛋白(CP)相互作用的人蛋白，共84种人蛋白作为潜在的Mtb相互作用体，其中44种人蛋白同时与Mtb分泌蛋白(SP)和 Mtb细胞蛋白(CP) 相互作用(图2A)，图2B中展示了部分相互作用蛋白。
图2. 人蛋白芯片鉴定与Mtb相互作用蛋白
(A) Mtb SPI(绿色)和CPI(红色)的维恩图。(B)新确定的结核、结核和消费者物价指数的代表。调用正候选项的截止时间设置为信噪比> 2.0。实验分两次重复进行。
通过IPA软件，研究人员进一步分析了Mtb潜在相互作用靶点在细胞功能和通路中的作用。筛选出前20个典型通路，如图3A所示。在疾病和生物功能的IPA分析中，筛选出变化最显著的前10个类型，如图3B所示，涵盖了IPA的“分子和细胞功能”和“生理系统发育和功能”两大类。
图3. 利用IPA软件分析Mtb相互作用靶点
(A) IPA典型通路分析显示20条通路发生显著改变(p值< 0.05)；(B)前10个变化显著的项目，包括分子和细胞功能、生理系统发育和功能。
3. MTB蛋白芯片筛选人蛋白结合靶点
为了确定与宿主蛋白相互作用的Mtb效应因子，研究人员从候选人蛋白中选择NRF1和SMAD2作为验证蛋白，这两个蛋白均与SP和CP结合。研究人员纯化NRF1和SMAD2蛋白，用Cy3标记后与Mtb蛋白芯片孵育，发现了三个潜在与NRF1结合的蛋白（Rv2239c、Rv0577、Rv2499c)和六个潜在与SMAD2结合的蛋白（Rv0577 、Rv2499c、Rv2423、Rv3241c、Rv3153 、Rv2117)。
图4. Mtb蛋白组芯片筛选NRF1和SMAD2结合蛋白
4. 体外实验验证芯片结果
为了验证Mtb效应因子与NRF1或SMAD2之间的相互作用，研究人员纯化了Rv0577、Rv3153、Rv2117和Rv2423蛋白，通过pull down发现NRF1可以与Rv0577相互作用, SMAD2可与Rv0577、Rv2117和Rv2423相互作用,用Co-IP进一步验证，结果与pull down一致。这表明，Rv0577是Mtb与人PPI的关键位点。
图5.体外实验验证蛋白相互作用
（A、B)pull down实验验证蛋白互作；(C、D、E) CO-IP验证蛋白互作。
本研究基于蛋白质芯片发现Mtb与宿主蛋白相互作用，这将有助于病原体与宿主之间完整相互作用的研究，同时也为结核药物的开发提供潜在的靶点。
本研究中所使用的Huprot人蛋白芯片和MTB蛋白芯片博翀生物均可提供。
广州博翀生物科技有限公司是一家专业提供蛋白质芯片，凝集素芯片，药物小分子芯片等产品和定制服务的高科技公司。公司为中国科学院生物物理研究所成果转化的标杆企业，专注于蛋白芯片技术和产品，自主研发并实现MTB蛋白芯片的产业化，2014年正式成为CDI的代理商，拥有成熟的蛋白质芯片技术服务平台和实践经验。
博翀生物人蛋白芯片简介：
博翀生物MTB蛋白芯片简介：
