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博翀芯片定制服务助力肝细胞癌血清标志物筛选
发布时间：2020-07-28 11:23 | 点击次数：
概述：
肝细胞癌（HCC）是一个全球性的疾病，每年新增病人数超过 70 万，死亡率居恶行肿瘤第二。甲胎蛋白（AFP）是 HCC 早期诊断中经典的标志物，而由于其低灵敏度导致的假阴性问题较为普遍，因此临床上需要更有效的早诊标志物。但是，在新的标志物筛选中，常常面临着两个问题，第一，系统性、全局性不够；第二，精准度不够，即从海量的原始数据无法精准定位某一个或几个靶标分子。
为解决上述问题，近日，复旦大学附属中山医院肝癌研究所高强团队基于 Huprot 人类全蛋白质组芯片系统性、全局性的筛选 HCC 早期诊断标志物，通过集成逻辑回归（logistics regression）、人工神经网络（Artificial Neural Network）算法建立了针对 HCC 的精准区分模型，模型中包含了 CIAPIN1，EGFR，MAS1，SLC44A3，ASAH1，UBL7 和 ZNF428 这 7 种蛋白质，最后通过独立样本对模型的泛化能力进行验证。该研究在《Journal of Hematology & Oncology》在线发表 (IF = 11.059)。
研究思路：
肝细胞癌（HCC）是一个全球性的疾病，每年新增病人数超过 70 万，死亡率居恶行肿瘤第二。甲胎蛋白（AFP）是 HCC 早期诊断中经典的标志物，而由于其低灵敏度导致的假阴性问题较为普遍，因此临床上需要更有效的早诊标志物。但是，在新的标志物筛选中，常常面临着两个问题，第一，系统性、全局性不够；第二，精准度不够，即从海量的原始数据无法精准定位某一个或几个靶标分子。
为解决上述问题，近日，复旦大学附属中山医院肝癌研究所高强团队基于 Huprot 人类全蛋白质组芯片系统性、全局性的筛选 HCC 早期诊断标志物，通过集成逻辑回归（logistics regression）、人工神经网络（Artificial Neural Network）算法建立了针对 HCC 的精准区分模型，模型中包含了 CIAPIN1，EGFR，MAS1，SLC44A3，ASAH1，UBL7 和 ZNF428 这 7 种蛋白质，最后通过独立样本对模型的泛化能力进行验证。该研究在《Journal of Hematology & Oncology》在线发表 (IF = 11.059)。
研究思路：
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
该研究包括三个阶段：Discovery Phase（I）、Test Phase（II）、Validation Phase（III）。
蛋白芯片筛选潜在标志物
在 discovery 阶段（I），基于人类全蛋白质组芯片（芯片包括 >20,000 新测序的重组人源蛋白，覆盖率 81%，是目前世界上通量最高的蛋白质芯片）筛选出 HCC 血清中的特异性免疫高响应的自身抗体（AAb），共计筛选出 81 个（图 A）；在 test 阶段（II），联合相关文献报道的 19 个蛋白（共计 100 个），制备成肝癌特异的小芯片，并通过样本测试重复性，结果显示测试阵列呈现高重现性（图 B）；用制备的小芯片进行大样本量测试，展示 HCC 患者、肝硬化患者、健康对照各一例的信号强度的三维渲染（图 C）。
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
ANN（人工神经网络）模型建立
在 Test 阶段（II），基于定制芯片测试结果，分别比较分析 HCC 与 Cirrhotic、HCC 与 healthy 数据，并基于 p-value <0.05，fold change ≥ 1.2，sensitivity>15%，specificity>90% 判定标准，筛选出 55 个潜在的生物标志物。
为了更加精准筛选出具备显著区分能力的单个或多个标志物，基于逻辑回归（logistics regression）算法对 55 种潜在的生物标志物进行进一步筛选，并通过 10-fold cross validation（图 A）筛选出 7 个蛋白，分别为 CIAPIN1，EGFR，MAS1，SLC44A3，ASAH1，UBL7 和 ZNF428。
基于筛选出的标志物，通过神经网络中 error BackPropagation 算法建立多个人工神经网络 (ANN) 模型，并将模型进行集成，对肝细胞、肝癌患者和其他对照样本进行区分。在项目研究中建立的人工神经网络为全连接前馈神经网络，网络分为三层，输入层为 7 个神经元，隐含层为 5 个神经元，输出层为 2 个神经元，激活函数和输出函数均为 sigmod 函数（图 C）。其中，所建立的 7-AAb panel 的 ANN 模型的 sensitivity = 68.6%，specificity = 92.1%，AUC = 0.894（HCC VS 对照 [健康+肝硬化]），优于 AFP（临界值 = 400 mg/mL，sensitivity = 28.4%，specificity = 98.7%，AUC = 0.808）。
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
ANN（人工神经网络）模型验证
在 validation 阶段 (III)，577 例样本 (279 例肝细胞肝癌, 179 例正常, 119 例肝硬化患者) 作为独立样本，通过盲测法对模型进行验证；在盲测过程中，通过训练产生的模型委员对每例样本进行投票，确定是否肝癌患者，最后通过临床确诊信息来确定模型的准确度。
ANN 模型的工作流程图
（Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.）
对于建立的 ANN 模型，通过独立样本验证其泛化能力。验证结果中，sensitivity = 68.6%，specificity = 90.1%，AUC = 0.902（HCC VS 对照 [健康+肝硬化]）（表 1），并且对于 AFP 阴性患者，即 AFP 指标无法检出的患者，ANN 模型的 sensitivity = 80.6%，specificity 90.1%，AUC = 0.926（AFP- HCC VS 对照 [健康+肝硬化]）（表 2）。综合，ANN 模型的灵敏度（62.2-77.5%），优于 AFP（30.7%）。
当结合阶段（II）和阶段（III）的数据时，整体 sensitivity = 71.6%，specificity = 90.0%,AUC = 0.898（HCC VS 对照组 [健康+肝硬化]）（表 2），对于 AFP 阴性患者，整体 sensitivity = 76.1%，specificity = 89.1%，AUC = 0.912（AFP-HCC 与对照组 [健康+肝硬化]）（表 2）。
表 1. 在 HCC 检测中评估 7-AAb panel 和 AFP
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
表 2. 在 AFP- HCC 检测中评估 7-AAb panel
Shu Zhang,et al.Journal of Hematology & Oncology.2020.
ANN 模型应用
乙型肝炎表面抗原（HBsAg）可用于确定患者是近期还是长期感染 HBV。实验中，大约 70% 的 HCC 患者为 HBsAg+。对于 HBsAg+-HCC 检测，该模型提供了 59.6-79.1% 的灵敏度和 85.2-95.5% 的特异性（AUC = 0.822～0.932），而 AFP（临界值 400 mg/mL）提供了 31.4-34.7% 的灵敏度和 96.7-100% 的特异性。说明 ANN 模型能够有效地检测出 HBsAg--HCC 患者。
小结：
在本研究中，Huprot 人类全蛋白质组芯片和定制芯片的应用，为标志物的筛选提供了系统性和全局性的解决方案，而人工神经网络（ANN）算法能从海量的原始数据中精准定位相关的靶标分子，为筛选出肝癌相关标志物组合提供新思路。
博翀生物可提供相关芯片实验服务及人工神经网络（ANN）算法。
参考文献
[1]Shu Zhang,et al. Autoantibody signature in hepatocellular carcinoma using seromics. Journal of Hematology & Oncology.2020.
关于我们
广州博翀生物科技有限公司为体必康集团子公司，同时也是中科院生物物理所成果转化的标杆企业之一。博翀生物是以系列蛋白芯片产品、质谱蛋白质组学（iTRAQ、TMT、DIA 等产品）、代谢组学产品及其整体科研解决方案等为特色，整合科技、临床和产业资源，为科研和创新转化领航的高科技企业。
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