上期回顾

在HuProt™人类蛋白质组芯片和定制芯片的应用中，研究者从全局性、系统性的视角进行了SLE的标志物筛选，共计筛选出25个全新的自身抗体标志物，并通过临床大队列验证了其中一个。该项研究为系统红斑狼疮疾病的临床诊断和机制研究提供了方向和基础。

查看上期：《揭开自身免疫性疾病的面纱》

 

引言

在疾病研究中，我们很容易从表型入手找到与某种疾病相关的影响因子。然而想要攻克疾病需要明确疾病产生的分子机制，找到与影响因子相互作用的关键靶蛋白，才能开发出最有效的治疗手段。细胞分子机制错综复杂，许多通路仍不明确，更无法了解每一个蛋白的功能特性，导致疾病信号通路研究门槛高和研究周期长。因此疾病机制研究需要更快速、更精准、更可靠的筛选工具找出关键蛋白靶点，而HuProt™人类蛋白质组芯片能够助力攻克这一难题。

 

研究背景

昼夜节律是由生物钟（circadian clock）驱动引起的身体、心理和行为变化，我们日常的睡眠-觉醒周期就是最典型的昼夜节律现象之一。昼夜节律功能障碍会导致代谢紊乱、肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等。越来越多的研究表明，生物钟可以调节脂代谢参与肥胖的发生和发展，昼夜节律紊乱引起的脂类代谢改变会增加肥胖症风险。在分子水平上，昼夜节律基因通过转录和转录后反馈形成回路，其中周期节律调节器（period circadian regulators, PERs）是通路中的关键调节蛋白。PER家族由PER1、PER2、PER3组成，尽管已有文献报道PER3与脂肪生成相关，但PER3是如何调节脂肪生成的分子机制仍不明确。

 

中南大学湘雅三院的研究团队利用转录组学分析，和HuProt™人类蛋白质组芯片高通量筛选找到了PER3的关键靶点HSP90AA1，两者相互作用抑制Notch1信号通路，进而促进脂肪生成。该项研究揭示了PER3是脂肪生成的关键调节因子，在治疗肥胖症中发挥了关键作用，研究成果在Cell Death and Disease发表。

 

权威期刊在线发表

 

研究思路

 

研究结果

1、发现临床现象——PER3在肥胖个体的脂肪生成和脂肪组织中高表达

研究人员首先探索正常和肥胖个体的腹部皮下脂肪组织（SATs）和内脏脂肪组织（VATs）中PER3的表达，使用q-PCR检测PER3 mRNA 水平。结果显示，在肥胖个体中PER3高表达。同时，在高脂饮食的小鼠体内也检测到PER3高表达。这些结果提示PER3与脂肪生成相关。

 

qPCR结果显示在人个体（左）和小鼠个体（右）肥胖组体内脂肪组织PER3表达量更高

 

2、调控机制分析——PER3是脂肪生成的正调节因子

为进一步验证PER3与脂肪生成的关系，研究人员分别检测过表达（Ad-hPER3）和敲降（LV-shRNA- hPER3）PER3细胞内脂肪累积量和脂肪生成相关基因表达情况。结果显示，细胞内脂肪生成和相关基因表达情况与PER3表达量呈正相关，提示PER3是脂肪生成的正向调节因子。

 

各组实验注解：

Ad-NC：使用阴性对照腺病毒感染细胞组，作为过表达实验的阴性对照

Ad-hPER3：使用包装过表达PER3质粒的腺病毒感染细胞，使细胞内PER3大量表达

LV-shRNA-NC：装载阴性对照shRNA的慢病毒感染细胞组，作为敲降实验的阴性对照

LV-shRNA-hPER3 ：装载PER3干扰RNA的慢病毒感染细胞，使细胞内PER3表达量下降

 

油红O染色实验检测细胞内脂滴累积

 

3、作用靶点筛选——PER3与靶蛋白相互作用负调控Notch1通路

要探索脂肪生成中的PER3调控机制，就需要知道PER3影响信号通路。研究人员使用RNA测序 （RNA-seq）研究敲降PER3与正常细胞的转录组学差异。结果显示，敲降PER3导致Notch和氧化磷酸化通路被富集且表达上调（upregulation），一些参与调节脂肪分解、脂肪生成和不饱和脂肪酸生物合成的途径被富集和表达下调（downregulation）。在Notch通路中，DLL1、Notch1、Notch2和HES5等20个基因上调。以上结果说明在PER3低表达的情况下，细胞内脂肪生成通路相关基因表达下调，而Notch1通路的基因表达显著上调，提示PER3对Notch1通路具有负调控作用。

 

左图为基因本论分析（Gene Ontology，GO）展示基因富集通路

*点大小代表通路富集的基因数，红点代表上调途径，蓝点代表下调途径

 

右图为热图（Heatmap）展示细胞内Notch通路代表基因表达情况

*红色代表基因表达上调，蓝色代表基因表达下调

 

 

锁定Notch1信号通路后，为进一步探索hPER3调控Notch1信号通路的机制，研究团队首先进行Co-IP⁺ 质谱（MS）分析，找到了与PER3相互作用的蛋白。另一方面用HuProt™人类蛋白质组芯片检测与Notch1启动子组合的蛋白，筛选条件为信噪比（SNR）≥1.3，总共筛选出837个可能的蛋白靶点。结合Co-IP⁺ MS和HuProt™人类蛋白质组芯片的两个数据集，找了168个与PER3和Notch1相关的潜在基因。

 

HuProt™人类蛋白质组芯片蛋白互作聚类分析找到837个潜在蛋白靶点

 

4、作用靶点验证——PER3与HSP90AA1相互作用抑制Notch1通路

参考已有文献报道，研究团队最终选择HNRNPK和HSP90AA1进行Co-IP实验，证明了HSP90AA1与PER3蛋白相互作用。结果表明，PER3可以与HSP90AA1相互作用，并以HSP90AA1为桥梁与Notch1的启动子结合，调控脂肪生成。

 

总结

该项研究利用HuProt™人类蛋白质组芯片系统性、全局性的特点，筛选获得调控Notch1通路的关键蛋白，进而阐明了人PER3（hPER3）调控脂肪生成的分子机制。该项研究有助于了解昼夜节律如何影响脂肪细胞的发育、生长，为临床治疗肥胖症等疾病提供新思路。

 

从整体研究思路来看，该项研究是从临床的现象和问题出发，基于转录组、蛋白质组学技术筛选关键的靶标蛋白，并通过相关分子、细胞实验进行靶标验证，以科学、严谨的态度探求问题背后的本质。体必康科研以同样的理念致力于“让临床科研不再难”，不仅提供单一的组学技术服务，还提供解决临床问题的整体研究方案，与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

参考文献：Wan X, Zhu L, Zhao L, Peng L, Xiong J, Yang W, Yuan J, Liang F, Zhang K, Chen K. hPER3 promotes adipogenesis via hHSP90AA1-mediated inhibition of Notch1 pathway. Cell Death Dis. 2021 Mar 19;12(4):301.

 

部分图片来源：参考文献及网络

 

本文作者：吴若兰

 

下期预告

HuProt™人类蛋白质组芯片助力于疾病机制系统全面研究，为攻克疾病治疗确定关键蛋白靶点提供了更有效的治疗方案。那么，在药物治疗过程中，又该如何确定药物的有效性和它的作用机制呢？