引言

抗体是基础科研和临床分析常用的工具之一，由于抗体对于靶蛋白的识别是特异性的，因此它可以作为传染病及恶性肿瘤诊断的工具，也可以与各种毒素或药物通过化学偶联组成导向性的生物药来做到精准施药等。抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。

一、研究背景

目前，关于抗体制备方法主要有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单B细胞抗体制备技术。尽管这些抗体开发的策略比较成熟，但全球用于科研的抗体在质量、一致性以及可用性等方面普遍存在问题。研究认为，造成这一问题的主要原因是缺乏标准化的抗体验证标准，表现在抗体供应商对其产品的保密程度、抗体交叉反应评估技术难度大等。

 

业界已经做了一些努力来解决这些问题，以期提高抗体产品质量。其中，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）提出针对人转录因子蛋白进行抗体生产和验证标准化实践的试点项目PCRP（Protein Capture Reagents Program），并针对737种人转录因子生产出1406种高特异性的单克隆抗体（mAb），通过HuProt™人类蛋白质组芯片进行特异性评估，最后建立了标准化、高质量的单克隆抗体生产检验流程。该项目成果在《Nature Methods》发表。

 

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二、PCRP标准流程

PCRP是单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）生产和特异性检测的标准化流程，主要包括：抗原生产，杂交瘤细胞制备和抗体生产，HuProt™人类蛋白质组芯片进行抗体特异性检测验证，免疫沉淀（IP）、免疫印迹（IB）、免疫组化（IHC）和染色质免疫共沉淀（ChIP）等进行抗体功能验证，抗体杂交瘤细胞入库杂交瘤银行（DSHB）。该流程的关键点在于利用HuProt™人类蛋白质组芯片对抗体进行全局性的筛选和验证，高效快速进行单克隆抗体特异性的评价。

 

PCRP管线进行单克隆抗体生产和验证的标准流程

 

三、单克隆抗体的生产

抗体制备的方法主要有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单B细胞抗体制备技术。

① 杂交瘤技术，是一种应用广泛且最为经典的单克隆抗体制备技术，核心原理是将免疫后小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞株，进而生产纯化获得单克隆抗体。

② 噬菌体展示技术，是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。

③ 单个B细胞抗体制备技术，是近年来新发展的一类快速制备单克隆抗体的技术，是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性B细胞，通过单细胞PCR技术从单个抗体分泌B细胞中扩增IgG重链和轻链可变区基因，再在哺乳动物细胞内表达并获得具有生物活性的单克隆抗体。

 

单克隆抗体制备方法总览

 

在PCRP项目中，研究人员通过文献调研和整合，确定参与转录调控的核心蛋白1453个，并用于小鼠免疫（共接种了3599只小鼠），再通过杂交瘤融合筛选及ELISA检测，共产生了122662个单克隆抗体。

 

四、单克隆抗体的筛选

研究人员基于HuProt™人类蛋白质组芯片对所制备的单克隆抗体进行特异性的检测，通过S-score、Z-score评分法对每个抗体的结合情况进行评估，并通过ELISA、IP等技术进行筛选后的确认，最后筛选出针对737个转录因子的高亲和力和高特异识别的单克隆抗体1406个，且对比实验结果也表明HuProt™人类蛋白质组芯片筛选到的抗体能保证较高的特异性。

 

HuProt™人类蛋白质组芯片筛选抗体

（Z-score代表抗体特异性，S-score代表抗体亲和力）

 

五、单克隆抗体的功能验证

为验证筛选出的抗体的性能，研究人员表达其对应的靶标蛋白，并通过IP-MS、SPR、ChIP、IHC等实验对HuProt™人类蛋白质组芯片筛选的单克隆抗体进行一对一验证。结果表明，通过芯片筛选的单克隆抗体性能优异，能够通过最严格的免疫荧光敲除细胞系验证特异性实验（下图A），且第三方机构检测（下图B-D）的实验结果也表明抗体性能好，可重复性强。

 

单克隆抗体性能验证

 

六、总结与拓展

HuProt™人类蛋白质组芯片覆盖了人类蛋白质图谱定义的81%标准蛋白质，其中89%的为全长蛋白，且固定的蛋白质均能保证天然构想和生物活性。这些特点为单克隆抗体的特异性评估提供了全局性、高精准性的解决方案。

 

HuProt™人类蛋白质组芯片筛选抗体的流程

 

此外，CDI-lab利用HuProt™人类蛋白质组芯片检测了已经商业化的抗体，分别从A和B公司购买抗体产品，通过Z-scoer、S-score评分方法来评估抗体性能，结果显示A公司的抗体性能较好且特异性强，而B公司提供的抗体存在较多的交叉反应且抗体质量差。由此可见，HuProt™人类蛋白质组芯片对抗体进行特异性筛选验证是一种高效简洁的方法，未来很有可能会发展成抗体质量检测和评估的标准性规范。

 

HuProt™人类蛋白质组芯片验证商业抗体特异性

 

 

体必康科研

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此外，我们能从蛋白序列设计、表达、纯化及特异性抗体开发来开展系列研究和服务，采用杂交瘤技术、噬菌体展示技术等，开展目标靶点的鼠、兔单克隆抗体、纳米抗体制备及抗体性能优化等。

体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

 

参考文献：

[1] Venkataraman A,et al.A toolbox of immunoprecipitation-grade monoclonal antibodies to human transcription factors.[J].Nature Methods.

[2] Blackshaw S,et al.The NIH Protein Capture Reagents Program (PCRP): a standardized protein affinity reagent toolbox.[J].Nature Methods.

[3] Pedro Ramos,et al.Antibody Cross-Reactivity Testing Using the HuProt™ Human Proteome Microarray.[M].A CDI Laboratories White Paper.

 

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参考文献

 

本文作者：黄恺浩