引言

结核病（TB）又称“痨病”，是由结核分枝杆菌（Mtb）感染引起的慢性传染病。只有卡介苗是目前获准使用的结核病疫苗，能有效预防婴幼儿结核性脑膜炎和播散性结核病。但卡介苗针对青少年及成年人的保护效果欠佳，因此亟需一种对更多人群有效的结核病疫苗。

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一、研究背景

结核分枝杆菌（Mtb）能够破坏宿主的免疫反应并建立潜伏感染，与许多其他病原体不同，它能够在细胞内潜伏数年，通过控制吞噬体成熟、防止吞噬体与溶酶体融合以及减少吞噬体的酸化来实现这种长期的细胞内持久性。卡介苗（BCG）是目前全球应用于预防结核病的疫苗，目标人群为婴儿和新生儿，可使其发生结核病的风险降低50%。但考虑到BCG疫苗对青少年和成人的保护作用有限，对已感染结核分枝杆菌人群的保护效果也欠佳，因此开发新型高效疫苗、提高疫苗免疫强度、增长疫苗保护时间等成为结核病防控的主要研究方向。

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二、结核病疫苗研发现状

近些年，研究者们一直致力于BCG的改良和结核病新型候选疫苗的研发。其中一种类型为亚单位疫苗，由蛋白抗原和佐剂组成，安全性好且容易修饰，但因免疫原性弱，所以需要与佐剂联合使用。目前，进入临床试验二期阶段的亚单位疫苗包括M72/AS01E、H56:IC31、ID93+GLA-SE、GamTBVac（详见图1）。而亚单位疫苗的研究依旧面临许多挑战，后续研究将主要聚焦于筛选有效的抗原（或组合）与高效的佐剂、建立稳定且重复性高的动物实验模型以及统一的评价指标等。

图1：不同目标人群的不同亚单位疫苗

 

 

三、动物模型发挥的作用

借助动物模型的研究来帮助认识临床结核病的发病机理，这也是由临床结核病治疗药物和疫苗研发必需的技术过程所要求和决定的。小鼠、豚鼠和猴子是最常用到的3个结核病动物模型，每个模型都有其特点（详见图2-3）。在当前阶段，为满足临床药物和疫苗评价研究的需要，也为充分研究不同宿主结核病发病特征机理，小鼠、豚鼠和猴子结核病模型都是必然需要的。

 

1、小鼠模型

小鼠模型是最成熟且最普遍的结核病研究模型，应用小鼠模型进行结核病研究有很多优点，如小鼠实验成本低、易操作、种系遗传背景清晰等。它和人类一样能产生强烈的免疫反应，有利于进行重复验证。
 

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2、豚鼠模型

豚鼠模型是最早在结核病研究中用到的动物模型，其肉芽肿组织与人的结核病肉芽肿组织很像。这个模型是结核病疫苗和新药物效果评价非常重要的技术手段。

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3、非人灵长动物（猴子）模型

虽然这样的模型非常昂贵，但由于这是所有结核病研究动物模型中最接近人的，因此基于猴子的结核病研究仍然是非常迫切和重要的。

 

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图2：三种常用结核病动物模型的不同特点

 

图3：三种常用结核病动物模型的特征对比

 

 

而对于结核病的研究来说，一个标准理想的动物模型就是能够较大程度地模拟Mtb对人体的自然感染过程，且在宿主发病过程中所产生的相关免疫反应也与结核病自然发生发展的过程最接近。以呼吸道感染的方式接种Mtb是最理想的结核病动物模型的细菌接种方式。低剂量感染模型是当前结核病动物模型研究的通用模型，可以形成稳定且标准的慢性结核病发病模型。而是否能够进入潜伏感染状态，并可控制地由结核潜伏感染状态进入活动性结核病发病状态，决定了这个动物模型在结核病研究中的实际应用价值和意义。

 

 

四、疫苗研究思路与应用

H56:IC31是一种加了佐剂的亚单位疫苗，H56组合了3种结核分枝杆菌抗原（Ag85B、ESAT-6和Rv2660c）， IC31佐剂可以促进增强Th1反应。非人灵长类动物模型对结核分枝杆菌易感，感染的临床和病理学结果与人类感染相似。试验以食蟹猴作为模型对象，验证H56:IC31疫苗是否能增强卡介苗诱导的免疫原性和保护作用。

 

Philana Ling Lin等人进行了两个实验，见图4。

实验1，检测H56:IC31作为卡介苗增强疫苗是否能对高剂量结核分枝杆菌（500 CFU）的侵袭提供保护作用。

实验2，对低剂量（25 CFU）的疫苗接种进行评估，以确定疫苗是否会导致更高的潜伏感染率。如果不接种疫苗，低剂量感染会导致大约50%的动物发展为潜伏感染，而其余的则发展为活动性疾病。

 

在这两个实验中，研究人员监测食蟹猴对疫苗抗原ESAT-6、Ag85B和Rv2660c的反应，以及对CFP10的反应（CFP10是一种存在于结核分枝杆菌，不存在于卡介苗中的免疫原性蛋白）。

 

图4：实验设计概述

实验1：设3组，(a)对照组(n=6)；(b)仅接种卡介苗(n=6)；(c)卡介苗接种后第14周和第17周接种H56 (n=6)。

所有组在卡介苗(星型)后23周感染高剂量结核分枝杆菌(500 CFU)。按指定时间间隔进行PBMC淋巴细胞增殖试验。感染后对食蟹猴进行了长达65周的随访。

实验2：设3组，(a)对照组(n=9)；(b)仅接种卡介苗(n=8)；(c)卡介苗接种后第8周接种H56，第12周接种第二剂H56 (n=8)。

接种卡介苗20周后，所有组均感染低剂量结核分枝杆菌(25 CFU)(星型)。在指定的时间间隔进行PBMC ELIspot检测。感染后对食蟹猴进行了长达45周的随访。

 

 

在用H56:IC31增强剂接种后，我们观察到食蟹猴对所有疫苗抗原和PPD的增殖反应增加。完成免疫后，三组食蟹猴感染结核分枝杆菌（500 CFU），感染后每4周采集一次血液样本直至采集64周，同时测量红细胞沉降率（ESR）以作为炎症的标志，见图5。

 

在受结核分枝杆菌感染的食蟹猴中，ESR的增加可能意味着发展为活动性结核。感染后，未接种组ESR水平随着临床疾病的进展而升高。接种BCG的食蟹猴ESR有延迟性增加，只有4只食蟹猴ESR增加。而用H56/IC31促进BCG作用明显，在攻毒后1年多观察也只有1只ESR阳性食蟹猴。

 

图5：高剂量结核分枝杆菌感染食蟹猴后的各结果展示

(A) 感染后64周的单个猴全血中ESR的测定；

(B) 攻毒后x射线阴性食蟹猴的占比；

(C) 根据预先设定的人道终点对食蟹猴进行临床检查和致死，生成生存曲线；

(D和E)：肺(D)和其他器官(E)的病理评分。

 

 

与高剂量Mtb动物模型相比，低剂量模型进展缓慢。为验证H56:IC31能改善结核潜伏感染的假设，试验比较了经BCG和BCG:H56-vac感染后食蟹猴的结核潜伏感染再激活情况。

 

抗TNF抗体能使大约70%的潜在感染食蟹猴迅速重新激活，而对于潜在感染的人类，TNF的中和则会急剧增加结核潜伏感染重新激活的风险。因此，推断TNF中和可以进行结核病疫苗预防潜伏感染再激活能力的测试。试验对4只接种BCG和BCG/H56组的结核潜伏感染食蟹猴进行抗TNF抗体治疗5周后尸检，结果显示4只使用BCG的食蟹猴中有3只重新激活了潜伏感染状态。与此形成鲜明对比的是，使用BCG/H56的食蟹猴均未表现出潜伏感染的重新激活，且所有食蟹猴的细菌负担都较低。这些数据表明，在暴露前进行H56疫苗加强接种可以防止结核潜伏感染的再次激活。

 

动物研究表明，用亚单位疫苗增强或补充卡介苗的策略确实可以增强对结核分枝杆菌感染的保护。在本研究中，试验证明了在Th1佐剂IC31中使用Ag85B-ESAT-6-Rv2660c（H56）三融合疫苗H56:IC31接种非人类灵长类动物，可以促进针对这三种蛋白质成分的抗原的免疫应答。总体数据表明，在食蟹猴结核动物模型中，BCG/H56:IC31方案比单纯BCG具有更强的保护作用。

 

 

总结

实验动物模型在结核疫苗研发中发挥着无可替代的作用，而基于动物模型的结核病免疫调控机理的研究，不仅是我们探索生命奥秘的理论研究基础，更是我们研究新型结核病疫苗和新型结核病控制药物的应用需求。

 

对此我们【体必康科研平台】不仅能提供各种科研动物实验，也致力于从多个技术方向结合专门制定的动物模型来研发新型结核病疫苗。

 

体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，以科学严谨的科研态度探究问题的本质，和临床医生一起，从临床问题出发，结合现代科学研究体系，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

 

参考文献：

[1] Lin Philana Ling,et al. The multistage vaccine H56 boosts the effects of BCG to protect cynomolgus macaques against active tuberculosis and reactivation of latent Mycobacterium tuberculosis infection.[J].The Journal of clinical investigation,2012,122(1).

[2] 金晶,龚蕴贞.结核病疫苗的前景[J].国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册),2004(04):154-158.

[3] 朱国峰,刘晓清.结核病比较免疫学时代的机遇和挑战[J].结核与肺部疾病杂志,2020,1(04):195-212.

[4] 张晓萌,徐彩红,庞学文,张帆.针对不同人群结核病新疫苗研究进展[J].中国公共卫生,2021,37(11):1698-1703.

[5] 杜京津,逄宇,李凌.结核病亚单位疫苗的临床研究进展[J].实用医学杂志,2022,38(06):673-677.

 

 

图片来源：网络及参考文献

 

 

本文作者：邱金萍