引言

传染病是由各种病原体引起，能在人与人、动物与动物或人与动物之间相互传播的一类疾病。感染性疾病的发生，是病原菌为在宿主体内生存和繁殖，与宿主免疫系统相互作用的结果，如结核分枝杆菌侵入宿主细胞，会在胞内存活并干扰宿主细胞的相关调控机制。
 

对于传染病的研究离不开对病原菌的研究，与针对病原菌单基因或单蛋白的传统研究方法相比，对病原菌进行全局性研究更有可能给攻克疾病带来突破。因此，研究人员迫切需要更高效、更系统的工具来研究病原菌与宿主的互作关系及病原菌的致病机制。蛋白质组芯片是将某一物种的所有蛋白质固定在特定修饰的固相载体上而集成的微阵列，以其全局性、系统性的优势，对特定物种如病原菌、人类等的研究提供全局性视角，为明确病原菌-宿主相互作用机制提供更高效的研究方法。

 

一、研究背景

结核病是由结核分枝杆菌（MTB）经呼吸道传播而引起的全身性慢性传染病，又被称为“白色瘟疫”。结核病是全球十大死因之一，同时自2007年以来，一直位居单一传染病死因之首，高于艾滋病。尽管世界卫生组织长期致力于防治结核病，但在2012年全球新发结核病患者仍达860万，死亡人数达130万。然而，研究人员对结核分枝杆菌的基本生物学了解不足，对致病作用机制不明，这在一定程度上阻碍了结核病治疗药物、疫苗和诊断测试的发展。因此，我们迫切需要更好的实验工具来加快对这种病原体的系统研究。
 

由中科院研究团队构建的全球首张结核分枝杆菌蛋白质组芯片，涵盖了结核分枝杆菌4262个蛋白质，覆盖率95%，可应用于蛋白间相互作用，小分子-蛋白结合以及血清生物标志物筛选等。这为结核分枝杆菌基础生物学的研究开辟了新途径。研究成果以《Mycobacterium Tuberculosis Proteome Microarray for Global Studies of Protein Function and Immunogenicity》为题在Cell Report上发表。

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二、研究思路

项目研究思路展示

 

该项目构建了全球首张MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片，该芯片包括4262个结核分枝杆菌蛋白质，覆盖95%以上的结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组编码的蛋白质。研究团队将MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片作为结核分枝杆菌蛋白的全局性分析工具，对结核病的关键蛋白（PknG）、小分子（c-di-GMP）和患者血清进行筛选分析，在结核分枝杆菌研究中取得突破性进展。

 

三、研究结果

1、MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片的构建

构建MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片的首要工作是获取到结核分枝杆菌蛋白。因此，研究团队利用Gateway Entry技术构建了结核分枝杆菌蛋白表达文库，并通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）系统通量表达芯片制备所需的所有蛋白，其中包含结核分枝杆菌标准株H37Rv基因编码的3829个蛋白质和结核分枝杆菌致病株CDC1551基因编码的433个蛋白质（图1A）。

 

研究团队使用GST免疫印迹法（图1B）和毛细管电泳技术（图1C）对纯化蛋白进行检测。结果显示，结核分枝杆菌蛋白与预期大小一致，且纯度良好，可用于芯片的制备。接着，他们通过微阵列制备系统构建MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片，并通过检测GST来评估芯片的质量（图1D）。

图1 MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片的构建

 

MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片最终由4262个结核分枝杆菌蛋白组成，含32%的假设蛋白（hypothetical proteins）、10%的膜蛋白和5%的分泌蛋白，与已知的结核分枝杆菌蛋白质组成一致，是全球首张由单个纯化蛋白组成且最全面的结核分枝杆菌蛋白质组芯片。

 

研究团队充分发挥MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片全局性、系统性的优势，分别应用于蛋白互作、小分子互作和血清生物标记物筛选，展示了MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片在结核病临床和基础研究中重要的应用前景。

 

 

2、PknG-结核分枝杆菌蛋白互作的全局分析

研究团队利用MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片对丝氨酸苏氨酸蛋白激酶G（PknG）进行全局性分析，筛选出PknG作用靶点，为PknG在结核分枝杆菌中的作用机制提供了思路。

 

研究团队纯化了V5标记的PknG，用于MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片筛选实验（图2A）。根据筛选实验结果，他们确定了59个候选PknG相互作用蛋白（芯片结果见图2B），并使用PANTHER分析潜在结合蛋白的富集情况，将PknG相互作用的结核分枝杆菌蛋白分为14个蛋白质类（图2C）。

 

研究团队使用生物层干涉仪（BLI）（图2D）和酵母双杂交分析（Y2H）（图2E）来进一步验证PknG与潜在互作蛋白的结合情况，其中RmlA和EchA13验证成功。此外，他们对RmlA（Rv0334）和Wbbl2（Rv1525）做进一步功能验证，结果表明，RmlA及Wbbl2可被PknG磷酸化（图2F），且RmlA与PknG的相互作用可显著抑制RmlA的活性（图2G）。

图2 PknG相互作用结核分枝杆菌蛋白的筛选

 

 

3、c-di-GMP-结核分枝杆菌蛋白相互作用的全局分析

研究团队使用MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片来鉴定结核分枝杆菌中关键第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的相互作用蛋白，对c-di-GMP在结核分枝杆菌中发挥的生理作用进行全局性分析（图3A）。芯片实验共筛选到30个与c-di-GMP相互作用的潜在蛋白（芯片结果见图3B）。这些数据表明，c-di-GMP可以与不同类别的蛋白质广泛结合（图3C），这与c-di-GMP信号传导参与调节细菌的许多生物过程的报道一致。同时，链霉亲和素印迹（图3D）和生物层干涉仪（BLI）（图3E）结果也与芯片筛选结果一致。

图3 c-di-GMP相互作用蛋白的筛选

 

 

4、结核病康复患者血清标志物的筛选

研究团队使用MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片检测治疗前的189例活动性结核病患者和150例结核病康复患者的血清，通过筛选评估结核病血清生物标记物，来弥补目前结核病诊断方法无法区分活动性结核病患者和康复患者的缺失。芯片筛选结果显示，疾病特异性抗原分层聚类（图4C），可以成功区分患者组和康复组，且患者组的13种结核分枝杆菌蛋白血清抗体水平明显高于康复组，GroEL（Rv0440）的抗体水平明显低于康复组（图4D）。最终，研究团队选定14个蛋白作为候选生物标记物（图5）用于鉴定活动性结核病患者和康复患者。以上实验的结果均表明，将利用MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片筛选出的生物标记物作为监测治疗结果的指标，具有良好的应用前景。

图4 活动性结核病患者及结核病康复患者血清标志物的筛选

 

图5 MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片筛选的潜在血清标志物列表

 

四、总结

研究团队基于酿酒酵母表达系统开发了全球首张结核分枝杆菌蛋白质组芯片，并应用于蛋白互作、小分子互作和血清生物标记物筛选，为结核病系统性研究奠定了坚实基础，也证明了MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片在结核病诊断预后标志物发现、致病机制、耐药机制、新药开发等相关临床和基础研究中有着重要应用前景。

 

体必康集团依托中国科学院生物物理研究所搭建了科研平台，沉淀并转化了一系列蛋白质组学技术（从基因克隆、载体构建、蛋白表达，到芯片制备、样本检测及分析报告等一系列标准化、专业化、工业化的蛋白质芯片研发和服务技术），得到了行业的广泛认可。除此之外，体必康科研平台还提供其他组学技术服务，如质谱、测序等。

 

体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，不仅提供单一的组学技术服务，还提供解决临床问题的整体研究方案，与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

 

参考文献：Deng JY,Bi LJ,et al.Mycobacterium Tuberculosis Proteome Microarray for Global Studies of Protein Function and Immunogenicity.[J].Cell Reports.

 

图片来源：参考文献

 

本文作者：吴若兰

 

 

下期预告

本文展示了MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片在蛋白、小分子互作关系的全局性分析，以及通过筛选血清标志物来区分活动性结核病患者和康复患者的应用前景。但除此之外，在结核病诊断与治疗中，临床医生还面临着诊断潜伏性结核感染患者的难题。

 

有统计表明，全球约有1/3的人口存在潜伏性结核感染，且目前仍不能直接诊断潜伏性结核感染。在活动性结核病患者和潜伏性结核病患者区分的难题上，MtbProt^®结核分枝杆菌全蛋白质组芯片又会发挥什么样的作用呢？