上期回顾

由中科院研究团队构建的全球首张结核杆菌全蛋白质组芯片，涵盖了结核杆菌4262个蛋白质，覆盖率95%，可应用于蛋白间相互作用，小分子-蛋白结合以及血清生物标志物筛选等。它是结核病研究突破利器，为结核杆菌基础生物学的研究开辟了新途径。

 

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引言

结核杆菌在入侵机体后，由于宿主巨噬细胞胞内吞噬和肉芽肿组织细胞外包裹可限制其复制，控制组织的破坏，从而实现病原体和宿主之间的动态平衡，继而感染者不会出现结核病临床症状，而是形成结核潜伏感染（LTBI）。据估算，我国大约有3.5亿结核潜伏感染者，其中5%-15%可能发展为活动性结核病。因为结核潜伏感染没有细菌学和影像学等活动性结核病的临床证据，主要依靠体内外对结核杆菌抗原刺激的反应，如结核菌素试验（PPD）和γ干扰素释放试验（IGRAs），来间接检测结核杆菌感染，从而提示宿主存在结核杆菌抗原致敏性。

 

但这些检测方法并不完美，我们仍然迫切需要更准确、更易于操作的早期LTBI患者诊断工具。蛋白质芯片是将某一物种的蛋白质固定在特定修饰的固相载体上而集成的微阵列，以其全局性、系统性的优势，对特定物种研究提供全局的视角，为区分结核潜伏感染和活动性结核病提供了良好的解决方案。

 

 

一、研究背景

目前，临床上在区分结核潜伏感染（LTBI）患者和活动性结核病（ATB）患者方面仍缺乏有效的方法，这在一定程度上阻碍了结核病的预防和控制工作。现有的所有方法都有其缺点，如检测周期过长（痰培养法），特异性差（痰涂片法），无法区分LTBI和ATB（PPD和IGRA）。

 

为解决区分LTBI和ATB的难题，江西胸科医院的科研团队基于休眠存活调节器（DosR）编码的结核杆菌（Mtb）抗原，构建了DosR相关结核杆菌蛋白质组芯片，并通过对活动性结核病患者和结核潜伏感染患者血清的筛选和分析，最终确定了由4种自身抗体（anti-Rv1860、anti-Rv3881c、anti-Rv2031c和anti-Rv3803c）形成的标志物组合，该标志物在鉴定LTBI和ATB上具有高灵敏度和高特异性。相关研究成果已在《Microbes and Infection》上发表。（IF=9.57）

 

注：

DosR类蛋白：是结核杆菌中的休眠调节子。研究表明，这类蛋白在结核杆菌休眠状态期间上调，被认为是研究结核潜伏感染的良好候选标志物。

 

权威期刊在线发表

 

 

 

二、研究思路

该研究共收集了活动性结核病（ATB）患者、结核潜伏感染患者（LTBI）及健康对照（HC）的共480份血清样本（ATB，n=160；LTBI，n=160；HC，n=160），并基于标志物研究的“经典三阶段”：发现（Discovery Phase）、测试（Test Phase）、验证（Validation Phase），来开展项目实验。

 

研究思路

 

 

 

三、研究结果

1、发现阶段：基于DosR芯片的潜在差异抗体筛选

研究团队利用Gateway技术成功构建了43个DosR蛋白和21个结核杆菌蛋白表达克隆，并利用酿酒酵母表达系统进行表达纯化，最后通过体必康科研平台的微阵列制备系统，成功构建DosR相关结核杆菌蛋白质组芯片。（图1）

 

图1 活动性肺结核特异的蛋白芯片

 

 

基于构建的DosR芯片对活动性结核病（ATB）患者、结核潜伏感染（LTBI）患者、健康对照（HC）的共180份血清样本（ATB，n=60；LTBI，n=60；HC，n=60）进行检测，以筛选结核杆菌蛋白抗原互作的特异性血清抗体。筛选结果显示，以活动性结核病为参照，结核潜伏感染特异蛋白19个，健康对照特异蛋白12个（图2a,b），其中Rv1860、Rv2031c、Rv3881c、Rv3803c和Rv0526这5个蛋白为两组共有（图2c,d），说明构建的DosR芯片具备区分活动性结核病和结核潜伏感染的潜在能力。

 

图2 不同组别间的潜在差异

 

 

2、测试阶段：通过ELISA扩大样本进行测试

为测试筛选出的自身抗体的有效性，研究人员基于标志物的灵敏度从5个潜在标志物中挑选了4个（Rv1860、Rv3881c、Rv2031c和Rv3803c），通过ELISA方法扩大样本进行验证（ATB，n=100；LBTI，n=100；HC，n=100）。结果显示，4个标志物在新队列的表达状态与芯片结果一致，即在活动性结核病患者、结核潜伏感染患者、健康对照样本中存在显著性差异。

 

图3 四个自身抗体通过新队列ELISA测试的结果

 

 

3、验证阶段：4-AAb-panel联合诊断性能分析

通过ELISA扩大样本验证确定的4个标志物已经具备临床鉴别诊断的潜力，但单一标志物在灵敏性和特异性上仍存在缺陷。因此，研究人员基于随机森林算法，对Anti-Rv1860、Anti-Rv3881c、Anti-Rv2031c和Anti-Rv3803c进行panel的联合，联合panel的效能通过ROC曲线进行评估。结果显示，这4种标志物联合的4-AAb-panel诊断模型中，结核潜伏感染患者、健康组、对照组的AUC分别高达0.976、0.971、0.972。这说明联合性能较好，具备临床应用的价值。

 

图4 蛋白联合分析模型结果

 

 

 

四、延伸拓展

除了DosR功能相关的结核杆菌蛋白芯片外，体必康科研平台基于结核杆菌的蛋白功能还构建了一系列功能芯片，包括结核杆菌分泌蛋白芯片、结核杆菌转录因子芯片、结核杆菌代谢途径蛋白芯片以及结核杆菌PE/PPE家族蛋白芯片等，该系列芯片为研究区分结核潜伏感染和活动性结核病的生物标志物提供了极大的帮助。

 

河北胸科医院的科研团队基于标志物筛选的三阶段，成功筛选并验证了4个蛋白标志物（Rv0934, Rv3881c, Rv1860和Rv1827）,其中结核蛋白Rv1860和Rv3881c均出现在上述两个科研团队的研究结果中，也说明了基于结核蛋白芯片进行血清筛选的有效性和重现性。该研究成果在《Scientific Reports》上发表。

 

河北胸科医院研究团队的科研思路

 

 

研究思路和结果：

① 发现阶段：研究人员构建结核杆菌分泌蛋白芯片（体必康科研平台提供）对205例ATB、123例LTBI和112例HC血清样本进行检测分析，通过差异分析筛选出23个差异表达蛋白。

 

② 测试阶段：研究人员通过功能富集分析、蛋白互作分析以及ROC分析，最终认为Rv0934、Rv3881c、Rv1860和Rv1827可作为潜在的蛋白标志物。

 

③ 验证阶段：研究人员用ELISA方法对额外52例ATB、123例LTBI和112例HC血清样本做进一步检测，以验证上述4个潜在蛋白标志物的特异性。结果显示，候选蛋白在ELISA的表达结果与芯片结果一致。

 

候选蛋白标志物的ELISA检测结果

 

 

 

五、总结

文中两支科研团队都借助体必康科研平台，构建并利用结核杆菌蛋白质组芯片，结合ELISA验证筛选出了一系列高灵敏度、高特异性的蛋白标志物，为区分结核潜伏感染和活动性结核病提供了良好诊断方案，能在一定程度上推动结核病的控制和消除。

 

定制蛋白芯片除了可以应用于区分LIBI和ATB，也为蛋白标志物的筛选提供了新的发展思路，使标志物的筛选更加高效和稳定，为科研结果对临床诊断新技术的开发提供了理论支撑。

 

体必康集团依托中国科学院生物物理研究所搭建了科研平台，沉淀并转化了一系列蛋白质组学技术（从基因克隆、载体构建、蛋白表达，到芯片制备、样本检测及分析报告等一系列标准化、专业化、工业化的蛋白质芯片研发和服务技术），得到了行业的广泛认可。除此之外，体必康科研平台还提供其他组学技术服务，如质谱、测序等。

 

体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，不仅提供单一的组学技术服务，还提供解决临床问题的整体研究方案，与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

 

 

参考文献：

[1] Li J, Wang Y, Yan L, Zhang C, He Y, Zou J, Zhou Y, Zhong C, Zhang X. Novel serological biomarker panel using protein microarray can distinguish active TB from latent TB infection. Microbes Infect. 2022 May 19:105002.

[2] Li Z, Hu J, Liu P, Cui D, Di H, Wu S. Microarray-based selection of a serum biomarker panel that can discriminate between latent and active pulmonary TB. Sci Rep. 2021 Jul 15;11(1):14516.

  

图片来源：
参考文献

 

 

本文作者：李锦龙

 

 

下期预告

在结核感染发病过程中，除了单个蛋白表达变化的影响，蛋白间的相互作用也扮演着同样重要的角色，对机体产生不同的影响。那么，蛋白间相互作用的关系，我们是否也可以利用结核杆菌蛋白质组芯片，来进行深入探究呢？