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研究团队利用MtbProt^®结核杆菌全蛋白质组芯片系统性、特异性和全局性的特点，筛选获得与STPK相互作用的结核杆菌蛋白，构建了STPK-结核杆菌蛋白相互作用网络，有助于结核杆菌调节途径和功能活性研究、筛选新药物靶点以及开发结核杆菌特异性药物。

 

查看上期：《结核杆菌如何导致结核病？蛋白质芯片揭示其致病途径》

 

 

引言

耐药结核病是引起全球结核病第三次回升的重大原因，是研究结核病的难点与热点。结核杆菌耐药性的产生主要有三种因素，一是结核杆菌的固有耐药性；二是结核杆菌在增殖过程中由于自然突变可导致少量耐药菌的产生；三是由于治疗不当等因素，导致敏感的主体菌群被杀灭，少量耐药突变株成为优势菌群而产生的获得性耐药。

 

而对结核杆菌耐药机制的研究，不仅能为临床选择抗结核药物并有效地进行疾病治疗提供理论基础，还能助力找到抗结核药物靶点，开发新的抗结核药物，从而有效地控制结核病发展，减轻患者的负担与痛苦。

 

蛋白质组芯片是将某一物种的所有蛋白质固定在特定修饰的固相载体上而集成的微阵列，可以用于药物小分子高通量筛选，以其全局性、系统性的优势提供全局视角，为结核杆菌药物机制研究提供了更高效的研究方法。

 

 

一、研究背景

近年来，随着结核杆菌耐药现象的出现，结核病重新蔓延扩散，成为所有传染病中导致患者死亡的主要原因，已是亟待解决的全球性公共卫生问题。目前对结核病的治疗以异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、yi an丁醇和链霉素五种一线药物为主。其中吡嗪酰胺（PZA）是烟酰胺的衍生物，它在进入结核杆菌体内后，在吡嗪酰胺酶（PZase）的作用下转化为活性成分吡嗪酸（POA），影响细菌正常代谢，发挥抗菌作用，是治疗结核病的关键药物。

 

但有数据显示，结核病患者的吡嗪酰胺耐药率为14.7%，耐多药结核病（MDR-TB）患者的吡嗪酰胺耐药率为60.5%，且呈逐年上升的趋势。然而，我们对吡嗪酰胺的耐药机制仍不明确，虽然已有研究表明在结核杆菌中发现过吡嗪酸外排，但相关的外排蛋白尚未确定。

 

为了解其中的原因，复旦大学华山医院研究团队利用MtbProt^®结核杆菌全蛋白质组芯片（体必康科研服务平台提供）筛选出药物作用靶蛋白，为吡嗪酰胺耐药机制的发生和发展提供了可靠的理论依据，为解决结核病耐药问题以及研发新型抗结核药物奠定了重要基础。相关研究成果已在《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》上发表。

 

权威期刊在线发表

 

 

 

二、研究思路

 

项目研究思路展示

 

 

 

三、研究结果

1、药物靶点筛选

研究团队利用MtbProt^®结核杆菌全蛋白质组芯片（体必康科研服务平台提供）鉴定出85个与药物活性成分吡嗪酸结合的结核杆菌蛋白。参考相关研究及文献报道，研究团队关注到其中4个与药物流出/转运功能相关的蛋白，分别是Rv0191（预测的阿拉伯糖流出通透酶）、Rv3756c（甘氨酸甜菜碱/肉碱/胆碱/L-脯氨酸ABC转运体通透酶），Rv3008（非特征性膜蛋白YhiD，参与耐酸性）和Rv1667c（大环内酯转运ATP结合ABC转运蛋白）。

 

MtbProt^®结核杆菌全蛋白质组芯片检测药物小分子的结果

 

 

 

2、药物靶点验证

为进一步验证潜在结合的结核杆菌蛋白是否与吡嗪酰胺耐药有关，研究团队在结核杆菌菌株H37Ra中过表达上述四种靶蛋白（Rv0191、Rv3756c、Rv3008和Rv1667c）。结果表明，四种靶蛋白基因的过度表达引起了结核杆菌的吡嗪酰胺耐药性。吡嗪酸敏感性测试结果也表明，4种过表达菌株均对吡嗪酸具有耐药性。

 

同时，为探究四种靶蛋白是否对吡嗪酰胺具有特异性，或是否能够转运多种不相关的药物，研究团队以同样的方式对其他药物进行了敏感性测试。结果显示，4种过表达靶蛋白菌株对药物异烟肼（INH）、yi an丁醇（EMB）、CFZ、阿米卡星（AMK）、链霉素（STR）和左氧氟沙星（LEV）都不会产生耐药性。

 

这些发现表明，Rv0191、Rv3756c、Rv3008和Rv1667c不参与转运其他抗结核药物，而是只参与了吡嗪酰胺的特异性排出。这也进一步印证了MtbProt^®结核杆菌全蛋白质组芯片结果的真实可靠性，且筛选获得的靶蛋白对于吡嗪酸耐药性的产生具有关键作用。

 

过表达靶蛋白菌株对吡嗪酰胺的敏感性测试

 

过表达靶蛋白菌株对吡嗪酸的敏感性测试

 

 

除此之外，研究团队利用GMTV（Genome-wide Mycobacterium tuberculosis Variation）数据库对靶蛋白与耐药菌株进行分析，结果表明Rv0191、Rv3756c、Rv3008和Rv1667c的突变与临床菌株的吡嗪酰胺耐药性相关。其中，Rv0191的突变最为常见。这些发现进一步验证，Rv0191、Rv3756c、Rv3008和Rv1667c的突变在结核杆菌临床菌株的吡嗪酰胺耐药性中起重要作用。

 

GMTV数据库分析结果

 

 

 

3、药物机制探究

在存在外排泵抑制剂利血平（resperine）、胡椒碱（piperine）和维拉帕米（verapamil）的情况下，Rv0191、Rv3756c、Rv3008和Rv1667c的过度表达导致吡嗪酰胺抗性降低。这进一步证明了这些靶蛋白具有外排泵功能，参与吡嗪酸药物外排并引起药物抗性。

 

外排泵抑制剂对过表达菌株的敏感性测试

 

 

 

四、总结

该项研究利用MtbProt^®结核杆菌全蛋白质组芯片系统性、特异性和全局性的特点，筛选获得与小分子药物吡嗪酸相互作用的结核杆菌蛋白，阐释了吡嗪酰胺耐药机制，有助于结核杆菌调节途径和功能活性研究、筛选新药物靶点以及开发结核杆菌特异性药物。

 

体必康集团依托中国科学院生物物理研究所搭建了科研平台，沉淀并转化了一系列蛋白质组学技术（从基因克隆、载体构建、蛋白表达，到芯片制备、样本检测及分析报告等一系列标准化、专业化、工业化的蛋白质芯片研发和服务技术），得到了行业的广泛认可。除此之外，体必康科研平台还提供其他组学技术服务，如质谱、测序等。

 

体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，不仅提供单一的组学技术服务，还提供解决临床问题的整体研究方案，与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

 

 

参考文献

Zhang Y, et al. Identification of novel efflux proteins Rv0191, Rv3756c, Rv3008 andRv1667c involved in pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis. [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2017, 61(8):AAC.00940-17.

  

图片来源

参考文献

 

 

本文作者：吴若兰

 

 

 

下一系列预告

 

临床科研中，基于基因表达和蛋白质合成进行的，无论是疾病研究（如肿瘤、结核病等）还是生理机制研究（如生长发育、生物钟等）都已经有非常成熟的模式，但蛋白翻译后修饰却常被忽略。

 

常见的蛋白质修饰包括磷酸化、甲基化、糖基化和泛素化等。其中糖基化在多种生物过程中起着关键作用，与糖尿病、神经退行性疾病和癌症等人类疾病相关。那么，在糖基化修饰蛋白研究上，蛋白质芯片又能发挥什么样的作用呢？