引言

大多数药物产生药理作用是通过其有效分子与机体生物大分子发生相互作用，从而引起机体生理、生化功能的改变。通过药物作用靶点筛选来研究靶点蛋白作用机制，可以阐明药物如何对疾病治疗起作用或者可能引起哪些副作用及不良反应，为了解疾病的发生发展机制，攻克复杂疾病奠定基础。然而，很多合成化合物或天然化合物靶点未知，生物活性不明，加上人体生理过程复杂，使得药物的发现非常困难。

 

HuProt™人类蛋白质组芯片包含超过21000种人类蛋白质和蛋白质亚型，覆盖了人类蛋白质图谱定义的81%标准表达蛋白质。它以系统性、全局性的优势，为药物小分子的靶标筛选及机制研究提供思路。

 

 

一、研究背景

帕金森病是仅次于阿尔茨海默病的第二大常见的神经退行性疾病，数据显示我国帕金森病人数约310万，已经成为“帕金森病第一大国”。随着老龄化问题的日趋严重，预计到2030年，中国帕金森病患者将激增至500万人左右，预计全球超过50%的帕金森病患者将来自中国。帕金森病会随着时间推移而渐进性加重，一旦早期诊断，就应尽早开展治疗。而开展治疗这类神经退行性疾病的药物靶点研究，对掌握治疗时机从而有效治疗起着重要作用。

 

北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室的曾克武/屠鹏飞团队在研究中药野马追的过程中发现了其中的活性成分——野马追内酯B（Eupalinolide B，EB）。该团队基于HuProt™人类蛋白质组芯片（体必康科研平台-博翀提供）等技术，揭示了野马追内酯B与USP7蛋白结合，并通过Keap1/Nrf2信号通路发挥抑制小胶质细胞活化的功能，从而达到抗神经炎症的作用，为神经退行性疾病的治疗提供了理论基础。相关研究成果已在《Science Advances》（IF=14.9）上发表。

 

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二、研究思路

项目研究思路展示

 

 

三、研究结果

1、药物作用靶蛋白筛选

 

在前期研究中，研究人员已发现天然衍生小分子野马追内酯B（EB）可下调一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）和TNF-α等炎症介质，可抑制BV-2小胶质细胞活化。（图1A）

 

为确定野马追内酯B的潜在靶标，研究人员构建了生物素修饰的野马追内酯B分子探针（图1B），利用HuProt™人类蛋白质组芯片（体必康科研平台-博翀提供）筛选潜在作用靶点。经过分析发现，潜在的靶点中，野马追内酯B与去泛素化酶7（USP7）结合产生的信噪比最高（图1C）。

 

为进一步验证靶蛋白的可靠性，经体外实验，研究人员发现在USP7低表达的小胶质细胞中添加野马追内酯B可逆转NO、IL-6和TNF-α的下调（图1D）。同时，免疫荧光分析结果表明，BV-2细胞中野马追内酯B（绿色）与USP7（红色）存在相互作用（图1E）。综上可以推断，野马追内酯B的靶蛋白是USP7，并且与其特异性结合后可以抑制由小胶质细胞介导的炎症反应。

 

图1  小分子野马追内酯B靶标筛选

 

 

2、药物作用位点分析

 

为进一步探索野马追内酯B与USP7相互作用的位点，研究团队基于SPR发现EB选择性地与非催化HUBL结构域相互作用，并确定了apo-HUBL结构（2.3 Å）和HUBL与野马追内酯B复合物的共晶体结构（2.35 Å）；经蛋白结构重构解析，发现EB以其α，β-不饱和羰基与USP7 HUBL结构域的576位半胱氨酸（Cys576）发生了共价结合，并通过氢键和范德华力紧密结合在USP7 HUBL中的负电荷腔体内（图2-1）。

 

图2-1  USP7 HUBL与野马追内酯B复合物结构

 

为进一步验证抗炎作用位点Cys576的可靠性，研究人员利用脂多糖（LPS）刺激USP7低表达小胶质细胞，分析细胞内炎症介质的表达水平。结果发现，在USP7对照组（USP7WT组）和USP7突变组（USP7Cys576A组）中，细胞内NO、TNF-α和IL-6表达水平没有明显差异。然而在使用野马追内酯B治疗后，USP7WT组细胞内的NO、TNF-α和IL-6表达水平降低，USP7Cys576A组中无明显变化。该结果证明，野马追内酯B作用于USP7的Cys576位点，从而抑制由小胶质细胞介导的炎症反应（图2-2）。

 

图2-2  野马追内酯B的作用位点验证

 

 

3、药物作用机制研究

 

为了解USP7是如何激活小胶质细胞并引起炎症反应的，研究人员利用同位素标记（SILAC）技术，对小胶质细胞降解的特定USP7底物蛋白进行分析（图3A），在野马追内酯B的作用下，有五种蛋白的表达量下降，其中已被证明在炎症过程中起关键作用的Keap1蛋白引起了研究人员的极大关注。

 

为进一步阐明细胞内USP7和Keap1的相互作用，研究人员用CHX阻断蛋白质合成，通过western blot技术发现NC siRNA转染的对照组细胞在使用CHX诱导12小时后，Keap1蛋白发生轻微降解（图3B）。这些结果进一步证明了Keap1降解是由USP7介导的结果。

 

综上，研究团队认为野马追内酯B通过抑制USP7活性，加快Keap1的降解，增强了小胶质细胞中的Keap1/Nrf2信号，从而抑制炎症反应。

 

图3  证明Keap1是USP7在小胶质细胞中的泛素化降解底物

 

 

4、药物治疗潜力研究

 

为进一步探究野马追内酯B对神经退行性疾病的治疗效果，研究人员还同时开展了动物实验。

对野马追内酯B的药代动力学特性进行评估，通过对小鼠胃内给药，在0.25~3h后检测小鼠脑内与血浆内的野马追内酯B浓度，明确了野马追内酯B具有良好的口服生物利用度，能够透过血脑屏障，达到治疗浓度（图4A）。

使用快速老化痴呆模型小鼠（SAMP8）进行水迷宫实验，并评价SAMP8小鼠空间学习和记忆性能。如图4B结果显示，在使用野马追内酯B治疗五天后，SAMP8小鼠的记忆有显著改善。

使用Nissl染色法检测，结果显示，与对照组SAM抗性小鼠（SAMR1）相比，未使用野马追内酯B治疗时，SAMP8小鼠大脑显示出明显的小胶质细胞激活，Iba-1和CD68免疫反应性增加。但使用野马追内酯B治疗后，这些标志物浓度明显下降；因神经受损而减少的Nissl，也在野马追内酯B的作用下有显著增加。TNF-α和IL-6的释放以及淀粉样蛋白斑块在野马追内酯B的作用下减少（图4C）。

 

这些数据表明，野马追内酯B可以有效缓解小胶质细胞介导的神经炎症，改善认知功能，在神经退行性疾病的治疗中发挥着重要作用。

 

图4  USP7抑制剂改善神经退行性发病机制的转化研究

 

 

四、总结

该项研究利用HuProt™人类蛋白质组芯片系统性、全局性的特点，筛选野马追内酯B直接作用的靶蛋白USP7，并通过体外、体内等实验确定了野马追内酯B是通过与USP7的非催化位点HUBL结构域结合，以达到对USP7的变构抑制。同时，通过研究确认了USP7是小胶质细胞中Keap1 / Nrf2信号通路抗神经炎症作用的关键调节因子。野马追内酯B作为第一个靶向USP7非催化结构域的小分子抑制剂，为老年痴呆、帕金森病等神经退行性疾病的治疗提供了新的研究方向。

 

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体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，不仅提供单一的组学技术服务，还提供解决临床问题的整体研究方案，与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

 

 

参考文献

Xiao-Wen Zhang, Na Feng,et al. Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy.[J]. SCIENCE ADVANCES.

  

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参考文献

 

 

本文作者：凌靖