引言

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是恶性浆细胞病中最常见的一种类型，又称骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤或Kahler病。目前，世界卫生组织将其归为B细胞淋巴瘤的一种，发病率估计为2~3/10万。多发性骨髓瘤作为一种血液系统的恶性肿瘤，以骨髓内浆细胞克隆性增生为主要特征。随着MM生物学机制的阐明及靶向药物的临床应用，MM治疗已取得较大进展，但大多数可用药物易产生毒副作用和耐药性。因此，寻找新的治疗靶点并开发有效的药物来克服MM耐药性和有效预防复发至关重要。

 

HuProt™人类蛋白质组芯片包含超过21000种人类蛋白质和蛋白质亚型，覆盖了人类蛋白质图谱定义的81%标准表达蛋白质。它以系统性、全局性的优势，为MM药物的靶标筛选及机制研究提供思路。

 

 

一、研究背景

蟾毒灵（Bufalin）是蟾蜍科动物中华大蟾蜍的干燥分泌物的主要成分之一，可通过诱导肿瘤细胞的分化和凋亡来发挥抗肿瘤作用，对包括多发性骨髓瘤（MM）在内的多种癌症具有显著抗癌作用。然而，Bufalin的潜在副作用和毒性却限制了其在临床上的应用。

 

为探究蟾毒灵治疗MM时产生的耐药机制并解决药物副作用的问题，南京中医药大学杨烨等研究团队利用HuProt™人类蛋白质组芯片（体必康科研平台-博翀提供）等技术筛选并鉴定了Bufalin作用的靶蛋白AHSA1，揭示Bufalin靶向AHSA1抑制MM增生的机制，并在国内首次合成了AHSA1选择性抑制剂KU-177，由于KU-177特异性靶向AHSA1，避免了蟾毒灵直接应用引起的毒副作用，最终达到了“减毒增效”的目的。该项研究成果为治疗MM提供了新的靶点及先导化合物，促进了克服MM耐药性和复发药物的开发。相关研究成果已在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（IF=12.658）上发表。

权威期刊在线发表

 

 

二、研究思路

项目研究思路展示

 

 

三、研究结果

1、Bufalin靶蛋白筛选

为明确Bufalin潜在的作用靶蛋白，研究团队基于HuProt™人类蛋白质组芯片（体必康科研-博翀提供）对Bufalin潜在的靶蛋白进行了系统性筛选，结果共发现428个蛋白质与芯片上的Bufalin有显著的相互作用（图A）。在筛选出的前5个靶蛋白（SEC13、AHSA1、TTC27、MAGEA8和SERPINB2）中，与正常血浆细胞相比，MM样本中只有AHSA1表达增加（图B），且AHSA1与MM患者的不良预后显著相关（图C-D）。同时，免疫组化（IHC）分析显示，相对于正常对照组织，AHSA1在MM原样品中表达强烈（图E）。因此，研究人员推断AHSA1可能是MM中Bufalin的新靶点。

HuProt™人类蛋白质组芯片筛选Bufalin潜在的靶蛋白

2、Bufalin靶蛋白验证

为进一步探究AHSA1与MM患者的耐药性是否相关，研究人员采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT比色法）测定了三种治疗MM的经典化疗药物：硼替佐米（BTZ）、卡非佐米（CZ）和多柔比星（ADR）的半抑制浓度（IC50）。结果证实，AHSA1的过表达诱导了蛋白酶抑制剂的抗性（图A-B）。同时，Bufalin可消除AHSA1诱导的BTZ耐药，并抑制野生型（WT）和BTZ耐药细胞的生长（图C）。

 

研究团队还进行了体内动物模型实验，使用野生型（WT）和AHSA1过表达（AHSA1-OE）细胞分别皮下注射到小鼠的左右腹部侧翼，并每周两次于腹腔内注射BTZ（1mg/kg）或ADR（1mg/kg）。实验结果显示，AHSA1的上调促进了MM细胞在体内的生长和BTZ的抗性（图D）。这也进一步证实了HuProt™人类蛋白质组芯片结果的真实可靠性，且筛选获得的靶蛋白对于MM患者耐药性的产生具有关键作用。

Bufalin与靶蛋白AHSA1作用情况验证

3、Bufalin作用机制阐释

为测定Bufalin是否能够降低AHSA1/HSP90诱导的MM细胞增殖和蛋白酶体抑制剂（PI）抗性，研究人员对依次经BTZ和Bufalin处理的MM细胞进行了Annexin V/PI染色分析。与WT细胞相比，AHSA1-OE细胞对BTZ诱导的细胞凋亡具有显著的抗性，而Bufalin处理可逆转AHSA1过表达引起的PI抗性（图A-C）,且该作用是通过降低AHSA1 WT/OE细胞中CDK6和PSMD2的表达来降低MM细胞增殖和PI抗性（图D）。

 

接着，为确定Bufalin是如何介导CDK6和PSMD2，研究人员使用经Bufalin处理及未经Bufalin处理的AHSA1-OE细胞进行了Co-IP分析，发现Bufalin利用每种抗体相互作为诱饵来干扰AHSA1和HSP90之间的相互作用（图E-F）。

 

研究人员进一步证实，Bufalin干扰了AHSA1和HSP90之间的相互作用并降低了CDK6和PSMD2（AHSA1/HSP90下游蛋白）的表达（图G）。此外，经Bufalin处理后，CDK6的活化形式，即CDK6处Y13位点的磷酸化也被减弱（图G）。这进一步证实了Bufalin能够降低PI抗性。

Bufalin抑制CDK6和PSMD2的表达进而降低PI抗性

4、KU-177作用机制阐释

为解决在临床治疗应用中Bufalin的严重副作用和毒性影响，研究人员合成了AHSA1的选择性抑制剂KU-177。实验结果表明，KU-177可以抑制细胞生长（图A-B）并诱导WT和AHSA1-OE细胞凋亡（图C-E）。此外，MTT比色法分析表明，KU-177治疗阻碍了原发性和复发性MM患者样本中MRD阳性细胞的细胞增殖（图F-G）。与Bufalin相似，KU-177干扰了MM细胞中AHSA1和HSP90之间的相互作用（图H-K），进而降低AHSA1/HSP90诱导的PI抗性。

KU-177干扰AHSA1和HSP90相互作用进而降低PI抗性

 

为进一步确定KU-177对AHSA1的抑制作用，研究人员构建了骨髓瘤小鼠模型，验证KU-177用于治疗骨髓瘤小鼠的剂量。结果发现，相较2mg/kg的剂量，每周两次1mg/kg的剂量可显著提高骨髓瘤小鼠存活率（图A）。且与对照组和单一治疗组相比，KU-177（1mg/kg，每周两次）和BTZ（1mg/kg，每周两次）的联合治疗大大延长了骨髓瘤小鼠的生存期（图B）。

KU-177和BTZ的组合显著提高骨髓瘤小鼠的存活时间

 

综上，AHSA1可能是MM细胞增殖和PI抗性的新靶点，而特定的AHSH1抑制剂有望用于MM的治疗。

AHSA1工作模型

 

 

四、总结

该项研究利用HuProt™人类蛋白质组芯片系统性、全局性的特点，筛选蟾毒灵直接作用的靶蛋白，并通过一系列体外、体内、功能验证等实验确定了蟾毒灵是通过与AHSA1蛋白结合，降低MM细胞增殖和蛋白酶体抑制剂抗性，来达到治疗和预防多发性骨髓瘤的效果。

 

体必康集团依托中国科学院生物物理研究所搭建了科研平台，沉淀并转化了一系列蛋白质组学技术（从基因克隆、载体构建、蛋白表达，到芯片制备、样本检测及分析报告等一系列标准化、专业化、工业化的蛋白质芯片研发和服务技术），得到了行业的广泛认可。除此之外，体必康科研平台还提供其他组学技术服务，如质谱、测序等。

 

体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，不仅提供单一的组学技术服务，还可以根据研究方向定制合适的动物研究模型，提供动物实验技术服务，并将分子细胞乃至动物实验等多项技术整合，为解决临床问题提供整体研究方案。与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

 

 

参考文献

Gu, C., Wang, Y., Zhang, L., et al. AHSA1 is a promising therapeutic target for cellular proliferation and proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 41(1), 11-24(2022).

 

图片来源

参考文献

 

 

本文作者：黄贞贞

 

 

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