上期回顾

体必康科研平台推出的Lectin56^TM凝集素芯片集合了56种常见的凝集素，具有高通量、高灵敏度、能够快速分析复杂成分的聚糖特征等优势，是研究糖基化的新兴技术。

 

研究人员利用凝集素芯片分析外周动脉疾病患者血清IgG糖基化的表达谱差异，筛选并获得用于疾病早期诊断的生物标志物，表现了凝集素芯片在疾病早期诊断以及发病机制研究上不可或缺的作用。

 

查看上期：《心脑血管疾病成死亡榜首！凝集素芯片带来早诊希望》

 

 

导语

迄今，人类已经发现了超过100种的自身免疫性疾病，影响全球2.5亿人的身体健康，其中育龄女性、有家族病史者和特殊职业从业者为高发人群。自身免疫性疾病（Autoimmune Diseases，AD）包括类风湿关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）和多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）等。由于这类疾病的发病机制尚不明确，目前还不能完全治愈。因此，采取有效手段开展高质量的机制研究，揭示疾病的发生发展机制，对于制定自身免疫性疾病的预防和治疗策略，至关重要。

 

免疫球蛋白G（IgG）是一种由血浆B细胞产生和释放的抗体，对IgG糖基化变化机制的研究有助于揭示自身免疫性疾病的发生发展机制。Lectin56^TM凝集素芯片集合了56种常见的凝集素，覆盖识别绝大多数糖链结构，为糖基化研究提供了全局性视角。北京大学第一医院研究团队利用Lectin56^TM凝集素芯片（体必康科研平台-博翀提供）全局性分析了不同细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-17A、BAFF和APRIL）刺激下IgG的糖基化水平及作用机制，为自身免疫性疾病的发病机制研究提供了研究思路。

 

 

一、研究背景

自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，通常可以分为器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫病。自身免疫性疾病会对机体免疫功能造成破坏，若未及时发现并治疗，患者病情将会加重，可能无法彻底治愈。

 

免疫球蛋白G（IgG）可以介导针对自身抗原的免疫反应，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）导致炎症和产生破坏，对体内免疫反应产生影响。IgG糖基化的变化作为一种病理特征，可以在各种自身免疫性疾病（AD）中被观察到。有研究报道，AD患者的炎症部位表现出细胞因子水平升高，且部分细胞因子能够促进AD发展的特征。同时，IgG糖基化模式在调节IgG的生物学功能和稳定性方面起着关键作用，与许多AD的病理生理学有关。然而，目前我们尚不清楚细胞因子干扰对IgG糖基化影响的细胞内调节机制。

 

为解决上述问题，北京大学第一医院研究团队利用Lectin56^TM凝集素芯片（体必康科研平台-博翀提供）等技术比较分析了不同细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-17A、BAFF和APRIL）刺激下IgG的糖基化水平及作用机制，为预防自身免疫性疾病的发生发展提供了新的研究思路。相关研究成果已在《Frontiers in Immunology》（IF=8.786）上发表。

权威期刊在线发表

 

 

 

二、研究思路

项目研究思路展示

 

 

 

三、研究结果

1、建立体外原代培养系统

为得到抗体分泌细胞（ASCs），研究团队分离人外周血单核细胞（PBMC），分选和纯化了CD19⁺B淋巴细胞且纯度高于98%（图1A），并使用体外培养系统培养CD19⁺B细胞。CD19⁺B细胞在第12天分别分化为浆细胞和浆母细胞（图1B,C）。

图1 B细胞体外分化为ASCs

 

在分化培养期间，研究团队以不同浓度梯度将细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-17A、BAFF和APRIL分别添加到培养系统中，对培养了12天的上清液进行分析。结果发现，IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-17A、BAFF和APRIL均可影响IgG的分泌。其中，IL-21浓度越高，IgG分泌的越多（图2C）；而其它细胞因子在不同浓度时会对IgG的分泌产生不同影响，呈现倒U形曲线现象（图2A,B,D-F）。根据IgG的峰值产量，在后续实验中，研究团队选择了以下细胞因子浓度：IFN-γ为2.5 ng/mL，TNF-α为50 ng/mL，IL-21为50 ng/mL，IL-17A 为20 ng/m L，BAFF为50 ng/mL和APRIL为3.13 ng/mL。

图2 不同浓度细胞因子刺激下的培养上清中IgG的浓度比

 

 

2、IgG糖基化谱筛选

为明确不同细胞因子对培养上清中IgG糖基化的影响，研究团队基于凝集素芯片（体必康科研平台-博翀提供）对不同细胞因子刺激下培养上清中IgG糖基化水平进行了检测。结果发现，在不同细胞因子刺激下，上清液中IgG的糖基化模式显示出相当大的差异（图3A）。其中，IFN-γ上调了IgG的半乳糖水平（图3B,RCA I）；IL-21（图3D,SNA-I）和IL-17A（图3E,SNA-I）上调了IgG的唾液酸化作用水平；IFN-γ（图3B,MNA-M）、IL-21（图3D,MNA-M）、IL-17A（图3E,MNA-M）和APRIL（图3F,MNA-M）上调了IgG的甘露糖基化水平；IFN-γ（图3B,DSL）、TNF-α（图3C,DSL）和IL-21（图3D,DSL）调节了IgG的乙酰葡糖胺水平。综上，每种细胞因子在调节IgG的糖基化过程中发挥着独特的作用。

图3 不同细胞因子刺激下IgG检测凝集素的S/N不同

3、IgG聚糖结构鉴定

为进一步探究IgG糖基化的变化机制，研究人员利用MALDI-TOF-MS鉴定从IgG释放的聚糖的结构，共鉴定出12种不同的N-聚糖结构（表1）；其中，有6种N-聚糖，分别为G2、G1FS1、G2FN、G1FNS1、G2FNS15和G2FNS2（F：岩藻糖基化N-聚糖，G0：半乳糖基化N-聚糖，G1：单半乳糖基化N-聚糖，G2：双半乳糖基化N-聚糖，S0：去唾液酸化N-聚糖，S1：单唾液酸化N-葡聚糖，S2：双唾液酸化N-聚糖）是由细胞因子刺激IgG释放所得，表明细胞因子刺激对IgG释放的聚糖结构产生影响。

 

表1 MALDI-TOF-MS检测12个IgG N-聚糖的结构

 

与对照组相比，IFN-γ组可检测到的含半乳糖的N-糖型，包括G1F、G2、G2F、G1FN、G2FN和G2FS1（图4B）。同时，与对照组（24.4%）相比，IFN-γ组的G0频率降低（19.2%）；而G1频率升高（70.9%）且高于其对照组（46.7%）；表明G1频率的增加可能促进了IgG与RCA-I的结合。

图4 不同细胞因子刺激的纯化IgG中N-聚糖的MALDI-TOF-MS谱

 

除此之外，与对照组相比，IL-21（图4D）和IL-17A（图4E）降低了S0的频率（IL-21组为92.6%，IL-17A组为93.3%，对照组为95.7%）。在IL-21和IL-17A组中，S1（IL-21组为7.0%；IL-17A组为5.6%；对照组为4.2%）和S2（IL-21组为0.4%；IL-17 A组为1.0%；对照组未检测到）的频率较高，与凝集素芯片结果一致。这也进一步证实了凝集素芯片结果的真实可靠性，在探究细胞因子干扰对IgG糖基化影响的细胞内调节机制具有关键作用。

 

研究团队利用MALDI-TOF-MS进一步鉴定了二等分的乙酰氨基葡萄糖糖型，包括G0FN、G1FN、G2FN、G1FNS1和G2FNS2，表明刺激组（IFN-γ组为39.6%，TNF-α组为50.4%，IL-21组为45.1%，IL-17A组为41.0%，BAFF组为28.9%，APRIL组为25.9%）的二等分糖型相对强度高于对照组（12.2%）。

 

综合MALDI-TOF-MS结构分析和凝集素芯片定量结果，可以证实IFN-γ增加了半乳糖聚糖比例，尤其是G1；而IL-21和IL-17A提高了唾液酸化糖型的频率。

 

4、IgG调节机制阐释

基于以上研究，研究团队进一步探讨了在IFN-γ、IL-21和IL-17A刺激下，半乳糖、唾液酸相关糖基转移酶和糖基水解酶的mRNA及蛋白质水平的变化。结果发现，与对照组相比，IFN-γ组的β-1,4-半乳糖基转移酶1的mRNA和蛋白质水平（B4GALT1）均增加，而β-半乳糖苷酶（GLB1）、ST6GAL1和NEU1的mRNA或蛋白质水平均未发现显著变化（图5A,B），表明IFN-γ调节的半乳糖增加是由于B4GALT1的变化引起的。

图5 不同细胞因子刺激下B细胞糖基化酶的变化

 

IL-21上调了β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1（ST6GAL1）、唾液酸酶1（NEU1）的mRNA表达（图5C）和ST6GAL1的蛋白表达，NEU1蛋白表达无显著差异；IL-17A上调ST6GAL1 mRNA和蛋白表达，下调NEU1 mRNA表达（图5E），NEU1蛋白表达无显著差异（图5D,F）；表明半乳糖和唾液酸的变化是由糖基转移酶而不是糖基水解酶的上调引起的。

 

综上，该项研究证实了微环境中的细胞因子通过调节B细胞胞内糖基化酶的表达，来促进IgG的分泌并改变其结构；同时揭示了微环境中糖链调控网络相互关联的复杂性，是IgG糖基化细胞内调控机制的重要补充。

 

 

 

四、总结

该项研究基于Lectin56^TM凝集素芯片系统性、特异性的特点，比较分析了不同细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-21、IL-17A、BAFF和APRIL）刺激下IgG的糖基化水平变化，并通过MALDI-TOF-MS等实验进一步验证分析，确定细胞因子通过调节B细胞胞内糖基化酶的表达，来促进IgG的分泌并改变其结构。同时，凝集素芯片筛选与质谱验证联用的思路，为糖基化机制的研究提供了系统且准确的解决方案，也为自身免疫性疾病外的其他疾病的糖基化研究提供了思路。

 

凝集素芯片作为研究糖基化的新兴技术，以其高通量、高灵敏度、能够快速分析复杂成分的聚糖特征等优势逐渐引起科研人员的广泛关注。与其他常规多糖分析方法（如质谱法）相比，使用凝集素微阵列可以直接进行糖谱全局性分析，且样品制备过程中不需要蛋白质碎裂或聚糖释放，因此可保证糖蛋白的天然构象。

 

体必康集团依托中国科学院生物物理研究所搭建了科研平台，沉淀并转化了一系列蛋白质组学技术（从基因克隆、载体构建、蛋白表达，到芯片制备、样本检测及分析报告等一系列标准化、专业化、工业化的蛋白质芯片研发和服务技术），得到了行业的广泛认可。除此之外，体必康科研平台还提供其他组学技术服务，如质谱、测序等。

 

体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，不仅提供单一的组学技术服务，还可以根据研究方向定制合适的动物研究模型，提供动物实验技术服务，并将分子细胞乃至动物实验等多项技术整合，为解决临床问题提供整体研究方案。与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

 

 

参考文献

Cao, Y., Song, Z., Guo, Z. et al. Cytokines in the Immune Microenvironment Change the Glycosylation of IgG by Regulating Intracellular Glycosyltransferases. Front Immunol, 12, 724379 (2021).

图片来源

参考文献

 

本文作者：黄贞贞

 

 

下一系列预告

凝集素芯片筛选与质谱验证联用，揭开了IgG糖基化细胞内调控机制的神秘面纱，为阐明疾病发生发展机制提供理论基础。蛋白质芯片帮助研究团队高效筛选出疾病中发挥关键作用的蛋白质、病原效应分子、糖等互作的生物大分子，然而决定这些生物大分子间相互作用的往往只是一个小小的蛋白质结合位点。

 

蛋白质结合位点是指蛋白质在具有生理活性时，蛋白质三维结构中不规则出现的空穴（cavity）和隧道（tunnel）与其他生物分子（底物、小分子、蛋白质等）结合并起重要作用的区域。近年来，药物研发已达到分子设计水平，利用小分子化合物调控蛋白功能，进而调控疾病发生发展已成为可能。而芯片作为高通量研究工具，在小分子药物靶点发现、致病蛋白抑制剂筛选等研究上，又能发挥什么样的作用呢？

 

 

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