为改善口腔溃疡，他们建了这几个动物研究模型
发布时间：2022-12-15 19:02 | 点击次数：
引言
口腔溃疡是最痛苦和最常见的粘膜疾病之一，其病因不确定且复杂，包括机械损伤、免疫失调、遗传易感性、激素水平波动、全身性疾病、微量元素缺乏、营养失衡、微生物感染、过敏因素、药物不良反应和心理应激等。口腔溃疡在我们生活中非常常见，比如复发性口腔溃疡就是一类常见的溃疡性疾病，在人群中患病率为5%-60%。口腔溃疡通常暴露固有层的神经末梢，从而引起疼痛，尤其在吃酸性或辛辣食物时，这严重影响了人们的生活质量。由于口腔溃疡疾病的复杂性，目前尚无具体的治疗方案。
研究表明睡眠与口腔健康密切相关，据报道睡眠障碍会增加牙龈发炎的风险。一些研究支持口腔健康不良和慢性全身性疾病（如糖尿病、神经退行性疾病和动脉粥样硬化等）存在密切的关系。由此可见，口腔健康和睡眠不足都与慢性全身性疾病（如神经退行性疾病）密切相关。因此，研究睡眠不足对口腔内稳态的系统性影响，有助于进一步了解睡眠不足如何影响人类健康。
药物的开发往往需要借助动物模型来做研究。因此，为筛选改善口腔溃疡的药物并对其活性进行评价，广东省科学院动物研究所与中山大学研究团队合作建立了ben fen诱导大鼠口腔溃疡模型、睡眠剥夺+ben fen诱导口腔溃疡模型。这两种动物模型的建立，为评价候选化合物或药物治疗口腔溃疡疾病的效果、睡眠障碍对口腔溃疡疾病的影响以及阐明治疗该疾病的作用机理奠定了基础。
Part.1：“睡眠剥夺”加重大鼠口腔溃疡并延缓愈合
一、研究背景
睡眠不足日益成为现代社会的特征，导致了一系列严重的健康问题。睡眠不足会引起口腔健康不良的原因有：①睡眠不足的人可能会承受更多的压力、抑郁、焦虑和疲劳，这可能会增加患口腔疾病的风险；②口腔疾病的患病风险似乎与睡眠不足引起的神经免疫内分泌系统和氧化应激改变直接相关。因此，睡眠不足可能是口腔健康的潜在危险因素。
然而，我们目前仍不清楚睡眠不足和口腔溃疡之间的关系，以及睡眠不足是否会影响ben fen诱导的口腔溃疡的愈合过程。为探究其中的关系，研究团队研究了睡眠不足对模型动物口腔溃疡的恢复、饮食、体重以及血清中的神经传导物质和炎症因子等方面的影响，证实睡眠不足会加重口腔溃疡并延缓口腔溃疡的恢复。相关研究成果发表在生物领域期刊Life Sciences上。
二、研究结果
研究团队首先建立了口腔溃疡大鼠模型（图1），将大鼠随机分为正常对照组和口腔溃疡组（OU组）。在第1天，OU组大鼠经异氟醚麻醉后，用95%ben fen溶液损伤其双侧颊黏膜；第3天时在口腔黏膜区形成几乎均匀的圆形溃疡。接着，将OU组分为了口腔溃疡组（OUO组）和口腔溃疡+睡眠剥夺组（OUS组）2个亚组。OUS组在第3到6天进行睡眠剥夺共72小时，再将睡眠剥夺后的大鼠放回正常鼠笼饲养3天，观察其口腔溃疡的恢复情况。
图1 实验设计示意图
图片来源：Life Sciences
从大鼠口腔溃疡区域的照片可以看出，与单独的口腔溃疡组（OUO组）相比，口腔溃疡+睡眠剥夺组（OUS组）的大鼠口腔溃疡的恢复过程较缓慢（图2A）。而且，OUS组大鼠口腔溃疡创口的面积显著大于单独的口腔溃疡组（图2B），说明睡眠剥夺延缓了口腔溃疡的恢复。
图2 口腔溃疡实拍（A）和不同时间点口腔溃疡面积的变化（B）
图片来源：Life Sciences
ben fen对口腔的损伤减少了大鼠对食物的摄取，而4-7天的睡眠剥夺进一步影响了大鼠的进食（图3A）。在整个实验周期，OUO组和正常组大鼠体重没有统计学差异，OUS组持续减轻体重，且明显低于其他组（图3B）。此外，OUO组和正常组大鼠体温也没有统计学差异，但OUS组大鼠体温升高，在第5-7天OUS组大鼠体温显著高于其他组（图3C）。
图3 睡眠剥夺对大鼠食物摄取、体重和体温的影响
图片来源：Life Sciences
同时，为研究睡眠剥夺对神经递质的影响，研究人员检测了不同实验组大鼠血清及脑组织中的γ-氨基ding suan（GABA）和5-羟色胺（5-HT）水平的变化。结果显示（图4）：在第3天，各组之间神经递质的水平无差异；在第6天，OUS组血清和脑组织中GABA和5-HT水平显著高于其他组；在第9天，OUS组脑组织中5-HT水平仍比对照组高，GABA水平在三组中无差异，而三组实验在血清中的神经递质水平无显著差异。这些结果表明，睡眠剥夺会导致血清和脑组织中的GABA及5-HT水平升高。
图4 血清、脑组织中5-HT和GABA水平变化
图片来源：Life Sciences
为研究睡眠剥夺对免疫系统的影响，研究人员又检测了不同实验组大鼠血清中免疫蛋白和炎症因子水平的变化。结果显示（图5）：在睡眠剥夺后的第3天，单纯口腔溃疡组（OUO组）大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平显著升高；在第6天，口腔溃疡+睡眠剥夺组（OUS组）所有细胞因子的水平都高于正常对照组；而且，睡眠剥夺后血清中的IL-1β、IL-6和MCP-1水平高于OUO组。检测结果表明，睡眠剥夺使血清中免疫蛋白的水平升高，ben fen诱导的口腔溃疡和睡眠剥夺使炎症因子水平都有升高的趋势，提示睡眠剥夺激活了大鼠体内的免疫反应。
图5 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和MCP-1的浓度变化
图片来源：Life Sciences
三、小结
上述研究中，研究人员利用ben fen及ben fen+睡眠剥夺组合诱导的2种口腔溃疡模型，较系统地研究了睡眠剥夺对口腔溃疡的影响。研究结果表明，睡眠剥夺会加重口腔溃疡，延缓口腔溃疡的愈合，同时还会影响神经递质（GABA、5-HT）、免疫蛋白（IgM）和炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1）的表达情况。
Part.2：多组学分析揭示大鼠口腔内稳态和慢性睡眠剥夺间的系统关系
一、研究背景
炎症被认为是将口腔疾病和慢性全身性疾病联系起来的关键因素。口腔炎症是一种常见的生理免疫反应，如果持续存在，可能会产生损伤，并增加病变进程的风险。此外，口腔黏膜可能伴有炎症介质的低水平慢性上调，这可能与微生物群落紊乱有关。某些低丰度的微生物病原体可以干扰宿主的免疫系统，重塑菌群，导致牙龈炎和牙周炎等口腔炎症疾病。已有研究证明，睡眠剥夺会影响口腔稳态，但睡眠剥夺和口腔微生物之间的联系尚未得到充分阐明。
为探究口腔稳态与慢性睡眠剥夺（CSD）的关系，研究团队利用健康大鼠和CSD大鼠血清代谢组学、舌根组织蛋白质组学及口腔微生物测序等方法，系统地阐述了CSD对口腔稳态的影响。相关研究成果发表在Frontiers in Immunology上。
二、研究结果
为探究慢性睡眠剥夺（CSD）对口腔黏膜的影响，研究人员对健康大鼠和CSD大鼠口腔黏膜组织进行了病理学检测。H&E染色和免疫组织化学染色结果显示，CSD促进了炎症细胞浸润，增加了口腔黏膜组织中炎症因子IL-6和IL-1β的表达（图6,7）。这些结果表明，CSD可引起口腔炎症。
图6 CSD对大鼠口腔黏膜的影响（大鼠口腔黏膜组织病理学改变）
图片来源：Frontiers in Immunology
图7 （A）对照组及CSD大鼠口腔上皮组织中IL-1β和IL-6的表达；（B）口腔上皮组织中IL-1β和IL-6的定量
图片来源：Frontiers in Immunology
为探究慢性睡眠剥夺（CSD）对细胞因子、神经递质和内分泌水平的影响，研究人员对血清中的细胞因子、神经递质和内分泌相关因子进行了检测。结果显示（图8）：CSD显著增加了血清中IL-6和IL-1β水平，降低了IL-10的水平；CSD还降低了血清中神经递质（5-HT、GABA）水平的表达；然而，与对照组相比，CSD未导致脑组织中5-HT和GABA水平的变化，同时神经递质水平在脑组织和血清中都没有显著改变；但CSD导致了血清中促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）和甲状腺激素（T3）水平的显著增加。这些结果表明，CSD可能激活了下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴和下丘脑-垂体-甲状腺轴，抑制了大鼠体内抗炎因子的分泌，从而介导睡眠剥夺诱发的炎症反应。
图8 CSD对细胞因子、神经递质和内分泌因子的影响
图片来源：Frontiers in Immunology
同时，为探究慢性睡眠剥夺（CSD）对口腔微生物群落的影响，研究人员对CSD干预前后口腔微生物组、血清代谢组和舌根蛋白质组进行了测定。分析结果显示（图9）：CSD大鼠口腔菌群的组成与健康大鼠明显不同；通过不同丰度细菌和生化指标变化的相关性分析，发现库特氏菌属与IL-1β水平呈正相关；气单胞菌属与IL-6、T3、CORT和ACTH的表达水平呈正相关，与GABA的表达水平呈负相关；金黄杆菌属与ACTH和CORT的表达水平呈正相关，与IL-10和GABA的表达水平呈负相关；水栖菌属与CORT和T3的表达呈正相关。这些结果表明，CSD可导致口腔菌群组成的改变，且不动杆菌属、金黄杆菌属和莫拉氏菌属与口腔细菌浸染显著相关，这可能是导致口腔炎症的部分原因。
图9 CSD对口腔微生物的影响
图片来源：Frontiers in Immunology
血清代谢组学分析发现，在慢性睡眠剥夺（CSD）组和对照组中存在不同的代谢谱。研究人员鉴定出84个不同的代谢物，通过KEGG代谢通路分析揭示出与CSD相关的6个主要代谢通路（图10）。此外，研究人员还对CSD组和对照组大鼠舌根组织的蛋白组学进行了研究，发现一共有977个蛋白存在差异表达。在977个蛋白中，有263个蛋白表达上调，714个蛋白表达下调。这些结果表明，CSD可以引起与慢性炎症相关的代谢通路，激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴；而通过对CSD干预大鼠舌体组织的蛋白表达谱的变化富集分析，研究人员发现了2个重要的通路：神经退行性疾病途径和免疫/炎症相关途径；多组学分析的结果表明，炎症反应相关模块与神经退行性相关模块呈正相关。
图10 CSD对大鼠血清代谢谱的影响
图片来源：Frontiers in Immunology
三、小结
该研究系统阐述了慢性睡眠剥夺（CSD）对口腔稳态的影响，讨论了其对系统性疾病可能的影响。研究人员整合蛋白质组、代谢组和微生物组学结果，揭示了大鼠口腔内稳态与CSD之间的关系，发现CSD会导致口腔稳态和口腔微生物组成的变化。而代谢组和生化分析的结果，进一步验证了口腔稳态在CSD影响人类健康中的作用。
全文总结
研究团队构建了ben fen诱导大鼠口腔溃疡模型、睡眠剥夺+ben fen诱导口腔溃疡模型，证实了睡眠剥夺会加重口腔溃疡并延缓口腔溃疡的愈合。同时，通过血清代谢组学、舌根组织蛋白质组学及口腔微生物测序等多组学组合分析，揭示了大鼠口腔内稳态和慢性睡眠剥夺间的系统关系。
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参考文献
1. Pan Chen, Hongliang Yao, Weiwei Su, Yudong He, Keling Cheng, Yonggang Wang, Wei Peng and Peibo Li. Sleep deprivation worsened oral ulcers and delayed healing process in an experimental rat model. Life Sci., 2019, 232, 116594.
2. Pan Chen, Hao Wu, Hongliang Yao, Jiashuo Zhang, Weiyang Fan, Zhen Chen, Weiwei Su, Yonggang Wang and Peibo Li. Multi-omics analysis reveals the systematic relationship between oral homeostasis and chronic sleep deprivation in rats. Front. Immunol., 2022, 13, 847132
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参考文献
本文作者：
关文，李沛波，姚宏亮
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