导语

随着人口老龄化加深及后疫情时代的到来，人们越发重视自我健康管理，而临床上关于疾病的治疗负担越来越重，存在着大量未满足的需求。基于此，在政策改革的趋势下，中国的新药研发也逐步向原研和创新方向靠拢，其中小分子药是创新药物开发的主力，并且已进入靶向时代。此外，信息技术与生物技术也呈现出更为紧密的融合势态，而基于靶点的药物设计技术已经成为药物开发的主流，其技术特点是利用高通量筛选（High-throughput screening，HTS）技术获得小分子和靶蛋白的复合结构，并在计算机的辅助下进行结构优化。其中，高通量筛选是小分子药物设计中发现有效结合化合物的关键步骤之一。因此，高通量、高质量的筛选工具成为了药物研发过程中的关键利器。

 

体必康科研平台的小分子微阵列芯片（Small molecule microarray，SMM），是将不同小分子药物（或待筛选化合物）集成在固相载体上形成微阵列，也称为药物小分子芯片。该芯片包含3375种小分子化合物（其中，1053种为中药单体、1527种为FDA批准的药物、795种为小分子抑制剂），可用于蛋白质、细胞裂解物、抗体、核糖核酸、活细胞等的配体化合物筛选。药物小分子芯片具有高通量、高灵敏度等特点，是靶向药物开发中的有力工具。

 

 

一、药物小分子芯片的制备机理

与蛋白质芯片制备方法相比，由于药物小分子缺少表面活性基团，无法直接点制固定，需要依赖高活性基团异氰酸酯（R-N=C=O）与化合物产生交联，固定于芯片上。原理如下：

1. 玻片表面进行氨基  硅  烷 化修饰；

2. 加入Fmoc-NH-(PEG)n-(CH2)2-COOH，通过酰胺键与氨基表面结合，交联PEG（PEG聚合物个数2~6不等）；

3. 加入PPDI（或1,6-二异氰酸酯己烷），通过脲键与表面偶联，生产异氰酸酯官能化基片；

4. 将待固定的化合物点制在玻片上，通过与异氰酸酯官能团结合进行固定。

 

 

 

二、药物小分子芯片的工作机理

待检测样本进行荧光/生物素标记后，与药物小分子芯片进行孵育，清洗去除游离的样本后，通过芯片扫描仪进行数据读取，并筛选特异性结合的小分子化合物。

 

 

三、药物小分子芯片的部分应用

1、蛋白检测

结合膜受体的细胞外蛋白通常在肿瘤发生中起关键作用，如血管内皮生长因子（VEGF）的过表达可以促进肿瘤增殖和存活，并破坏VEGF-激酶结构域受体（KDR）相互作用，但这类蛋白质的小分子抑制剂非常难找。Landry等使用药物小分子芯片筛选以鉴定VEGF-KDR结合的抑制剂，筛选了来自国家癌症研究所的7,961种化合物，发现12种VEGF-KDR（VEGFR2）相互作用抑制剂。

图1 VEGF-KDR结合的抑制剂筛选过程

（a）VEGF与SMM结合，产生VEGF配体作为抑制剂候选物；

（b）KDR与SMM的结合，然后与VEGF一起温育，揭示了捕获KDR并且仍然保持其与随后的VEGF的反应性的KDR配体；

（c）VEGF和VEGF配体的混合物与（b）中鉴定的KDR配体，进而抑制VEGF-KDR相互作用。

 

 

 

2、细胞裂解物检测

Miyazaki团队使用药物小分子芯片筛选来自RIKEN Natural Products Repository的>20,000种化合物，用于结合位于细胞裂解物中的核蛋白pirin。该团队将芯片与过量表达DsRed或DsRed融合的pirin的HEK293T细胞裂解物一起温育，并检测结合物的荧光读数。再通过ITC评估SMM阳性三苯基化合物A（TPhA），发现其与pirin高亲和力结合，后续的实验证明TPh A可抑制pirin与Bcl3的结合，而且在TPhA处理的条件下，黑色素瘤细胞迁移受到抑制。

图2 药物小分子芯片检测结果展示图

 

 

 

3、活细胞检测

Lee等人开发了一个药物小分子芯片平台，用于识别与活病原菌表面结合的小分子。该团队使用PEG linker将小分子固定在胺反应的功能化微阵列载玻片上，通过荧光团染色的活细菌细胞孵育后，将具有不同波长荧光团的四种细菌染色，用于四通道成像来评估小分子的亲和力和特异性。该研究开发了新类抗生素的新平台，并提供了验证活细胞应用与SMM互作验证的方法。

图3 基于微阵列的活细菌高通量筛选策略

（a）胺反应过程；（b）功能化的微阵列载玻片。

 

 

 

4、RNA检测

Labuda等人通过选择与已知RNA结合化合物具有相似性或具有与RNA堆叠和/或氢键结合潜力的亚单体，设计了一个RNA结合偏好的拟肽库，并使用药物小分子芯片鉴定了来自白色念珠菌（一种杀死免疫受损宿主的机会性病原体）的I组内含子RNA的拟肽。

图4 芯片检测及放射信号图

（a）芯片反应图，箭头指向来自化合物最高负载的点；

（b,c）每种拟肽结合物的放射性信号图。

 

 

总结

虽然药物小分子芯片在化合物库规模上低于其他高通量筛选技术，但其作为靶向药物的筛选工具，对靶点的天然构象有很好的保护作用，已经成为药物筛选中的利器。

 

体必康集团依托中国科学院生物物理研究所搭建了科研平台，沉淀并转化了一系列蛋白质组学技术（从基因克隆、载体构建、蛋白表达，到芯片制备、样本检测及分析报告等一系列标准化、专业化、工业化的蛋白质芯片研发和服务技术），得到了行业的广泛认可。除此之外，体必康科研平台还提供其他组学技术服务，如质谱、测序等。

 

体必康科研以健康中国为己任，致力于“让临床科研不再难”，不仅提供单一的组学技术服务，还可以根据研究方向定制合适的动物研究模型，提供动物实验技术服务，并将分子细胞乃至动物实验等多项技术整合，为解决临床问题提供整体研究方案。与临床医生一起，从临床问题出发，系统全面地解析生命过程的发生、发展机制。

参考文献

[1] Hong J A, et al. Recent discoveries and applications involving small-molecule microarrays [J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2014, 18(1):21-28.

[2] Landry J P, et al. Discovering small molecule ligands of vascular endothelial growth factor that block VEGF-KDR binding using label-free microarray-based assays [J]. Assay Drug Dev Technol, 2013, 11(5):326-332.

[3] Miyazaki I, et al. A small-molecule inhibitor shows that pirin regulates migration of melanoma cells [J]. Nature Chemical Biology, 2010, 6(9):667-673.

[4] Lee J H, et al. High-throughput screening of small molecule ligands targeted to live bacteria surface [J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(7):3508-3514.

[5] Labuda L, et al. Small Molecule Microarrays of  RNA-Focused Peptoids Help Identify Inhibitors of a Pathogenic Group I Intron [J]. Acs Chemical Biology, 2009, 4(4):299.

部分图片来源

参考文献

 

撰稿：杨思贤

 

下期预告

我们在开发小分子药物时，往往需要通过直接结合靶蛋白的“活性口袋”来抑制目标蛋白功能活性。然而，有些靶蛋白缺乏明确的配体结合“口袋”或对蛋白晶体结构研究极少，使得这些靶点变得“不可成药”，那么针对这些“不可成药靶点”，小分子芯片又是如何发挥作用的呢？

 

 

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